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"Les génomes peuvent être modifiés massivement par l’ingénierie génétique" par le Dr Mae-Wan Ho

Traduction et compléments de Jacques Hallard
mercredi 12 décembre 2012 par Ho Dr Mae-Wan

ISIS Biologie Microbes OGM
Les génomes peuvent être modifiés massivement par l’ingénierie génétique
Mass Genome Engineering
Avec d’importantes implications en matière de sécurité, des génomes microbiens entiers peuvent être modifiés à volonté, simultanément et rapidement,. Dr Mae-Wan Ho

Rapport de l’ISIS en date du 22/10/2012
Une version entièrement illustrée et référencée de cet article intitulé Mass Genome Engineering est disponible et accessible par les membres de l’ISIS sur le site http://www.i-sis.org.uk/Mass_Genome...;; elle est par ailleurs disponible en téléchargement ici
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  L’ingénierie du génome entier

La biologie synthétique va au-delà du génie génétique conventionnel : elle consiste en la manipulation des génomes entiers, à la fois avec un assemblage de pièces élémentaires, sous forme de données de séquences génomiques qui sont disponibles, et avec des gènes modificateurs qui sont dispersés danslensemble des génomes. Il faut souligner que ces techniques fonctionnent comme prévu avec les microbes, chez lesquels une recombinaison entre des séquences d’acides nucléiques homologues (similaires) est la règle. Cependant, chez les plantes et les animaux, des recombinaisons non omologues entre des séquences dissemblables sont prédominentes, et il est très difficile de cibler précisément les gènes. C’est pourquoi la modification génétique des plantes et du bétail est, par nature, incontrôlable et dangereuse, et les personnes qui, comme moi, l’ont souligné depuis que tout a commencé, ont eu bien raison (voir [1] ] GM is Dangerous and Futile, SiS 40). La biologie synthétique doit procéder avec prudence dans le ciblage des génomes de plantes et d’animaux, en raison de l’imprévisibilité et des dangers potentiels qui se sont multipliés à plusieurs reprises.
La motivation pour l’ingénierie des génomes, selon les chercheurs Peter Carr du Massachusetts Institute of Technology, et George Church de la Harvard Medical School, à Cambridge, dans l’état du Massachusetts aux Erats-Unis [2], est de comprendre ce qui se passe à travers leur construction, de produire des médicaments et des biocarburants avec un génome optimisé dans ce but, par exemple, pour utiliser des microbes comme biocapteurs, pour la bioremédiation, pour chasser et/ou détruire les cellules cancéreuses ; pour instruire nos propres cellules afin de minimiser le risque de choc septique, pour produire des organismes utilisant des codons fondamentalement modifiés, ce qui pourrait empêcher une souche de laboratoire d’ingénierie utilisant des gènes acquis, de transmettre ses caractéristiques d’ingénierie à des organismes sauvages. Ou tout simplement, la motivation est de « construire afin d’explorer de manière créative ».
Parmi les exemples de l’ingénierie des génomes, se trouve la construction du premier génome microbien à partir de cassettes disponibles dans le commerce, par l’Institut Craig Venter [3], ainsi que la suppression d’un grand nombre de larges segments du génome de la bactérie E. coli pour la débarrasser des éléments d’ADN instables, le transfert d’une grande partie du génome d’archées dans le génome d’eubactéries ; la décomposition du génome du bactériophage T7 en plusieurs modules reconfigurables ; la réalisation simultanée d’un grand nombre de modifications ciblées de génomes (voir ci-dessous), et le développement d’un système de traduction purifié utilisable pour le prototypage de fonctions génétiques in vitro sans nécessiter de déplacer des gènes dans des cellules vivantes. La manipulation de segments d’ADN de taille supérieure à 100 kpb dans les trois premiers exemples, s’est fortement appuyée sur les techniques de recombinaison in vivo.

  Une croissance super-exponentielle dans les technologies de l’ADN

Une technique-clé qui a permis de manipuler des génomes entiers est la synthèse de l’ADN à partir de zéro. Depuis que le premier gène synthétique a été produit dans les années 1970, la taille de l’ADN synthétisé a augmenté de façon exponentielle jusqu’au début des années 2000, quand il a alors connu une croissance super-exponentielle avec la construction de l’ensemble du génome entier de Mycoplasma genitalium, composé de 582.960 paires de bases (voir figure 1a) [2 ].
En outre, depuis le début des années 2000, le coût du séquençage et de la synthèse de l’ADN a considérablement diminué (voir figure 1b). Il a été possible, dès 2009, de produire un ADN de 100 kbp pour un dollar, et de séquencer 1 million de paires de bases pour 1 dollar (voir les deux courbes supérieures de figure 1b. Mais pour obtenir la construction génétique d’un ADN double brin, il faut un travail de conception important qui n’est pas aussi simple, et qui est très en retard sur le plan technologique (voir courbe du bas, Fig. 1b).
« L’ngénierie des génomes en est à ses balbutiements », selon la déclaration de Carr et Church [2]. Les nouvelles techniques ont permis de faire les premiers travaux, mais des outils plus sophistiqués sont nécessaires à tous les stades pour : « la modélisation, la construction de l’ADN et sa manipulation, la mise en œuvre, les tests et la mise au point ».
Figure 1 - Croissance des technologies de l’ADN depuis que le génie génétique a commencé dans les années 1970

  L’évolution artificielle accélérée est le mode préféré pour la manipulation des génomes

La procédure pratique et préférée pour la manipulation des génomes est la variation et la sélection, au lieu de la conception spécifique, une sorte d’évolution super-accélérée. C’est là que l’ingénierie des génomes de masse entre en jeu, avec ses deux grands avantages potentiels : la préexistence de modules hautement évolués dans les cellules et les micro-organismes, ainsi que la possibilité d’introduire des combinatoires et d’autres changements à l’échelle du génome, dans un laboratoire avec des techniques à haut débit. Une catégorie générale se concentre sur l’amélioration des fonctions existantes ou sur la sélection de nouvelles fonctions, grâce à cette évolution dirigée.
Les outils de la conception assistée par ordinateur (CAO) pour la conception et la simulation de haut niveau sont indispensables, de même que la mise en forme détaillée et les séquences d’oligonucléotides pour l’assemblage multiplex de gènes ou de génomes. La CAD spécifie les combinaisons complètes des modifications génétiques pour l’ingénierie métabolique et le dépistage basé sur une séquence, où le nombre de modifications à apporter est trop grand, comme la conversion des codons à l’échelle du génome entier dans la bactérie E. coli, où tous les codons d’arrêt TAG doivent être convertis en TAA (un autre codon d’arrêt). Les outils de CAO sont également nécessaires pour générer des voies métaboliques et de signalisation, y compris pour des processus non encore trouvés dans la nature. Un objectif majeur pour l’avenir est d’automatiser et d’intégrer les différents aspects [2] ; « depuis la conception des protéines, jusqu’à la compatibilité des normes et la propriété intellectuelle ».
Les sociétés de synthèse d’ADN utilisent généralement des robots de manipulation de fluides et des densités modérément élevées de plaques de réaction (dispositifs avec 96. 384 ou 1.536 puits), qui peuvent produire des méga-paires de bases de l’ADN par mois.
Une autre approche consiste en un traitement microfluidique, ce qui minimise l’emploi des réactifs et des matières consommables, et qui dépend de la synthèse en parallèle de séquences plus courtes qui sont assemblées par la suite en de plus longues unités.

  L’ingénierie des génomes automatisée multiplexage (abrégé en anglais ‘MAGE’ : une technique de programmation à grande échelle et d’évolution accélérée des génomes

L’ingénierie des génomes automatisée multiplexage (MAGE) est en cours d’élaboration pour la programmation à grande échelle et l’évolution accélérée des cellules [3]. La technique MAGE s’adresse simultanément à de nombreux sites sur le chromosome pour une modification dans une cellule ou dans une population de cellules, produisant ainsi des combinaisons étendues de la diversité génomique, destinées à sélectionner les combinaisons optimales. Le processus est cyclique et évolutif.
L’équipe de recherche dirigée par George Church a construit des dispositifs prototypes qui automatisent la technique MAGE, afin de faciliter la production rapide et continue de mutations. MAGE a été utilisée pour optimiser la voie de biosynthèse de la ‘1-désoxy-D-xylulose-5-phosphate’ (DXP) dans la bactérie E. coli pour surproduire le lycopène. Médiée par la protéine b de fixation des ‘ADN simple brin’ d’un bactériophage ‘I-Red’, le remplacement de gène est réalisé dans la souche bactérienne E. coli en dirigeant les oligonucléotides d’ADN simple brin sur le brin en attente au niveau de la fourche de réplication, lors de la réplication de l’ADN. Les ADN simple brin ont été introduits par électroporation.
Vingt gènes, décrits comme favorisant l’augmentation du rendement du lycopène, ont été ciblés dans le but d’optimiser la traduction de 90 oligonucléotides de base, contenant des séquences dégénérées du site de liaison du ribosome, flanquées de régions homologues de chaque côté. En outre, quatre gènes codant pour des voies secondaires ont été ciblés pour l’inactivation, par des séquences de remplacement, avec des codons d’arrêt afin d’améliorer le flux à travers la voie de la DXP. Ainsi, au total, 24 gènes ont été optimisés simultanément pour la production de lycopène.
Pas moins de 15 milliards de variants génétiques ont été générés. Le dépistage a été effectué en isolant les colonies qui ont produit une intense pigmentation rouge (due au lycopène) sur des plaques d’agar. Le séquençage de six variants a révélé un consensus de site de liaison ribosomique de la séquence Shine-Dalgarno (qui fait appel efficacement au ribosome pour commencer la traduction) dans les gènes situés au début et à la fin de la voie de biosynthèse, d’une part, et le gène ‘knock-out’ [qui rend silencieux] à partir des voies secondaires, d’autre part. Le rendement en lycopène a été mesuré : il va jusqu’à atteindre 9 mg / g de poids sec de cellules.
Dans une application ultérieure, à l’aide d’une stratégie générale de co-sélection avec des gènes marqueurs génétiques, au sein de sites ciblés d’environ 500kb, il a été réalisé la modification simultanée de 80 sites dans le génome de la bactérie E. coli [4].

  Est-ce bien inoffensif et sûr ?

La technique MAGE combine l’ingénierie des génomes ciblés avec la sélection, afin de créer rapidement de nouveaux génomes, présentant les caractéristiques requises, et le processus de modification du génome le plus efficace se profile à l’horizon. Ces changements massifs des génomes sont tenus pour avoir des effets non intentionnels à travers le gène, des interactions épigénétiques et métaboliques, et il est extrêmement important que les nouvelles souches créées soient complètement caractérisées et qu’une évaluation des risques soit effectuée.
Bien que le processus se déroule probablement selon les bonnes pratiques du confinement, ce dernier est-il suffisamment sévère ? Les déchets transgéniques - contenant des dizaines de milliards de nouveaux génomes créés à un moment donné – sont-ils déversés dans l’environnement et dans le milieu naturel ?
Ces nouveaux génomes pourraient offrir de nombreuses possibilités de transfert horizontal de gènes et de recombinaisons, d’une part, et créer par la suite de nouvelles souches de bactéries et de virus, d’autre part, et au moins certains d’entre eux peuvent être des agents pathogènes graves. Il est crucial d’éviter que cela ne se produise.

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 Définitions et compléments

Les génomes peuvent être modifiés massivement par l’ingénierie génétique

 Traduction en français, définitions et compléments

Jacques Hallard, Ing. CNAM, consultant indépendant.
Relecture et corrections : Christiane Hallard-Lauffenburger, professeur des écoles
Adresse : 585 19 chemin du Malpas 13940 Mollégès France
Courriel : jacques.hallard921 @ orange.fr
Fichier : ISIS Biologie Microbes OGM Mass Genome Engineering French version.3 allégée.


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