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"Alors que les limites de l’édition génomique sont à nouveau confirmées, les potentialités et perspectives des applications dans le vivant s’expriment toujours avec l’apparition d’outils annoncés comme prometteurs : ‘SpRY’ et le retron !" par Jacques Hallard

mardi 1er février 2022, par Hallard Jacques



ISIAS Génétique CRISPR Méthodes de sélection comparées

Alors que les limites de l’édition génomique sont à nouveau confirmées, les potentialités et perspectives des applications dans le vivant s’expriment toujours avec l’apparition d’outils annoncés comme prometteurs : ‘SpRY’ et le retron !

Jacques Hallard , Ingénieur CNAM, site ISIAS – 30/02/2022

Plan du document : Préambule {{}}Introduction Sommaire {{}}Auteur {{}}


Préambule

Communiqué rapide sur l’édition des gènes ou édition génomique ou édition du génome – Vidéo : Aperçu –1 minute 19 - Qu’est-ce que l’édition des gènes ? -Hendrix Genetics -24 avr. 2020

Source : https://www.hendrix-genetics.com/fr/vid%C3%A9oth%C3%A8que-fr/videos-dentreprise/quest-ce-que-ledition-des-genes/

Définition du retron  : c’est une séquence d’ADN distincte, trouvée dans le génome de nombreuses espèces de bactéries qui code pour la transcriptase inverse et un hybride ADN / ARN simple brin unique appelé ‘ADN simple brin multicopie’. Source Wikipédia (anglais) Voirin finedans ce dossier

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I
ntroduction en forme de résumé

A la lumière d’un récent article paru dans la revue scientifique ‘Nature’, ce dossier reprend – une fois encore - le sujet des technologies des modifications génétiques par l’édition des gènes ou édition génomique avec l’outil ‘CRISPR-Cas9’. Confirmant des études antérieures, les résultats de recherches rapportés dans cet article « mettent en évidence le fossé qui existe entre cette technologie d’édition des gènes et la sélection conventionnelle.

Cette technologie est reprise avec ‘Futura Sciences’ qui en explore les potentialités et des perspectives alléchantes ; parmi celles-ci, huit applications sont citées : créer des moustiques anti-paludisme : concevoir des bébés « améliorés » ; inventer des « super animaux » d’élevage ; ressusciter des espèces disparues ; cultiver des organes humains chez des cochons ; soigner les maladies par thérapie génique ; doper des végétaux et améliorer leurs qualités ; et même produire du biocarburant avec certaines micro-algues ou cyanobactéries , voire avec des levures génétiquement modifiées….

Et dans le même temps, des recherches appliquées et des expérimentations se poursuivent très activement : i est annoncé qu’une variante de l’outil d’édition génomique CRISPR-Cas9 (connu depuis 2012), dénommé ‘SpRY’, permettrait de modifier un gène virtuellement n’importe où et « cela serait une aubaine pour la recherche » !

Enfin, la nouvelle technique d’édition génétique « pourrait faire mieux que les ciseaux CRISPR » : elle constituerait un outil d’édition génétique plus simple et plus flexible… qui pourrait éviter les dommages collatéraux potentiels provoqués par les ciseaux génétiques CRISPR… » - Le suspense continue de s’exprimer !

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Sommaire

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  • Une nouvelle étude vient de mettre en évidence le fossé entre la technologie d’édition de gènes et la sélection conventionnelle - Traduction du 29 janvier 2022 – et ajout de définitions préalables - par Jacques Hallard d’un article de Claire Robinson diffusé le 20 janvier 2022 par ‘gmwatch.org’ sous le titre « New study highlights gulf between gene editing and conventional breeding  ; accessible sur ce site : https://www.gmwatch.org/en/2022/19971-new-study-highlights-gulf-between-new-genetic-engineering-and-conventional-breeding
    Illustration - Dans la nature, certaines zones du génome sont protégées des mutations - les résultats ont d’énormes implications pour notre compréhension de l’édition de gènes ainsi que pour la théorie de l’évolution. Rapport : Claire Robinson

Une nouvelle publication scientifique dans la revue ‘Nature’ montre que l’apparition de mutations (dommages à l’ADN) dans les génomes végétaux n’est pas aléatoire et que certaines zones du génome sont protégées des mutations. L’étude a également révélé que l’apparition et la fréquence des mutations dans les populations ne dépendent pas uniquement du mécanisme évolutif de la mutation aléatoire et de la sélection naturelle tel qu’il avait été traditionnellement compris.

Dans la sélection naturelle, les mutations aléatoires créent de nouvelles variations génétiques dans un pool de gènes. Ensuite, face à des contraintes environnementales telles que la sécheresse ou l’attaque de parasites, les plantes ou autres organismes présentant les variations génétiques et donc les caractéristiques les plus ’adaptées’ survivent et transmettent leurs gènes. On a longtemps pensé qu’il s’agissait là du principal moteur de l’évolution. Mais la nouvelle étude montre que les mutations dans les plantes ne sont pas aléatoires et sans direction, mais qu’elles sont orientées dans une direction qui profite à la plante.

Il est possible de conclure de cette étude que l’évolution n’est pas le fruit du hasard, mais semble être guidée par un mécanisme plus intelligent.

Une découverte inattendue

Comme l’explique un commentaire sur la nouvelle étude paru dans’ Phys.org’, les mutations se produisent lorsque l’ADN est endommagé et n’est pas réparé, créant ainsi une nouvelle variation. Les scientifiques voulaient savoir si la mutation était purement aléatoire ou si elle était plus profonde. Ce qu’ils ont découvert était inattendu.

’Nous avons toujours pensé que les mutations étaient essentiellement aléatoires dans le génome’, a déclaré Grey Monroe, professeur adjoint au département des sciences végétales de l’UC Davis et auteur principal de l’article. ’Il s’avère que la mutation est très peu aléatoire et qu’elle l’est d’une manière qui profite à la plante. C’est une toute nouvelle façon de penser la mutation’.

La nouvelle étude montre qu’il existe des mécanismes naturels dans le génome qui protègent certaines régions génomiques importantes contre les mutations fréquentes. Ainsi, au lieu du hasard, les scientifiques ’ont trouvé des zones du génome présentant de faibles taux de mutation. Dans ces parcelles, ils ont été surpris de découvrir une surreprésentation de gènes essentiels, tels que ceux impliqués dans la croissance cellulaire et l’expression des gènes.’

’Ce sont les régions vraiment importantes du génome’, a déclaré Monroe à ‘Phys.org’. ’Les zones les plus importantes sur le plan biologique sont celles qui sont protégées des mutations’.

Ces zones sont également sensibles aux effets néfastes de nouvelles mutations. ’La réparation des dommages causés à l’ADN semble donc être particulièrement efficace dans ces régions’, a déclaré le coauteur Detlef Weigel.

Les résultats remettent en question l’idée selon laquelle la plupart des modifications génétiques pourraient se produire naturellement.

Le nouvel article ne mentionne pas l’édition de gènes, mais il a des implications claires pour l’idée - très répétée par les partisans de la dérégulation - que les nouvelles techniques d’OGM comme CRISPR/Cas apportent principalement des changements qui pourraient se produire naturellement. En réalité, l’édition de gènes est spécifiquement conçue pour passer outre les protections naturelles contre les mutations, d’une manière qui ne se produit pas dans la sélection conventionnelle ou qui a très peu de chances de se produire.

Comme l’explique Testbiotech, dans l’édition de gènes, ’les ciseaux génétiques empêchent les cellules de restaurer la fonction originale du gène ; ils peuvent également passer outre d’autres mécanismes de protection naturels. Par exemple, en ce qui concerne les applications des ciseaux génétiques, l’endroit où les gènes sont situés dans le génome importe peu. En outre, CRISPR/Cas peut également bloquer la fonction de toutes les copies de sauvegarde d’un gène cible, qui peuvent être nombreuses dans le génome des plantes.

’Les plantes développées à l’aide de ces méthodes peuvent à la fois être profondément modifiées et présenter des combinaisons génétiques totalement nouvelles, même si aucun gène supplémentaire n’est inséré. Leurs caractéristiques biologiques peuvent être clairement différentes de celles que l’on trouve dans la sélection conventionnelle. Par conséquent, les risques associés à ces plantes doivent être évalués de manière approfondie.’

Les conclusions d’un article antérieur sont confirmées

Les nouvelles conclusions confirment celles d’un article scientifique publié en 2019 par le Dr Katharina Kawall du projet Génie génétique et environnement, qui compare explicitement l’édition de gènes avec la sélection conventionnelle, y compris les techniques utilisées avec la sélection conventionnelle, à savoir les techniques vieilles de plusieurs décennies de mutagenèse induite par des produits chimiques ou des radiations. Cet article montre que l’édition de gènes peut apporter des changements qu’il serait difficile, voire impossible, de réaliser par le biais de la sélection conventionnelle, soulignant ainsi les différences entre les deux techniques.

Commentant les deux articles, le Dr Michael Antoniou, généticien moléculaire basé à Londres, a déclaré : ’Ces résultats montrent que les affirmations selon lesquelles l’édition de gènes imite les processus naturels ne sont pas étayées par des preuves scientifiques. Ainsi, essayer de déréglementer l’édition de gènes sur la base de son supposé ’caractère naturel’ est infondé et très risqué, car cela peut conduire à des changements de composition involontaires dans le produit, avec des conséquences sur la santé et l’environnement.’

Références :
Mutation bias reflects natural selection in Arabidopsis thaliana
J. Grey Monroe, Thanvi Srikant, Pablo Carbonell-Bejerano, Claude Becker, Mariele Lensink, Moises Exposito-Alonso, Marie Klein, Julia Hildebrandt, Manuela Neumann, Daniel Kliebenstein, Mao-Lun Weng, Eric Imbert, Jon Ågren, Matthew T. Rutter, Charles B. Fenster and Detlef Weigel
Nature (2022). Published 12 Jan.
https://www.nature.com/articles/s41586-021-04269-6

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Source :https://www.gmwatch.org/en/2022/19971-new-study-highlights-gulf-between-new-genetic-engineering-and-conventional-breeding

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Technique de l’édition du génome

La technique consiste à couper l’ADN double brin en un site spécifique (et non au hasard dans le génome) grâce aux nucléases. Un morceau d’ADN est retiré ou ajouté puis l’ADN est ressoudé par recombinaison homologue.

Différentes nucléases peuvent être utilisées pour l’édition génomique. Par exemple, le système TALEN (transcription activator-like effector nucleases) utilise des enzymes artificielles créées en fusionnant un domaine de liaison à une séquence spécifique de l’ADN et le domaine catalytique de l’enzyme.

L’édition génomique avec CRISPR-Cas9

Le système CRISPR-Cas9 a été mis au point par les chercheuses Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna. Il a pour avantage d’être simple d’utilisation, rapide et peu coûteux. CRISPR signifie Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats et Cas CRISPR-associated. Dans ce système, des ARN guident la protéine Cas9 vers le site du génome à couper.

L’édition génomique permet de modifier des gènes durablement dans de nombreuses espèces, pour des applications variées. Ainsi, en agronomie, CRISPR-Cas9 est utilisé pour modifier des gènes de plantes cultivées comme le blé. Chez les animaux, CRISPR-Cas9 a été utilisé chez le moustique, le porc, la vache, mais aussi sur des embryons humains non viables, ce qui soulève de nombreuses questions éthiques.

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[EN VIDÉO] - Interview 4/5 : risques et enjeux des OGM - Avec la naissance des OGM et leur commercialisation apparaissent certaines questions. En effet, quels pourraient être les risques sanitaires et l’impact sur l’environnement de ces produits ? Afin de mieux comprendre les OGM et leurs enjeux, nous avons interviewé Jean-Louis Serre, professeur de génétique. Ecouter à la source

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©2001-2022 Futura-Sciences, tous droits réservés - Groupe MadeInFutura - ©2001-2022 Futura-Sciences, tous droits réservés - Groupe MadeInFutura – Source : https://www.futura-sciences.com/sante/definitions/biologie-edition-genome-16385/

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  • CRISPR : 8 applications d’édition génétique (Lire la bio) Par Céline Deluzarche Journaliste - Publié le 14/09/2019 - Modifié le 08/10/2020 – Document ‘Futura-Sciences’
    Le saviez-vous ? CRISPR est l’acronyme de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, qui peut se traduire par « Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées ».

Guérir des maladies génétiques, doper le rendement des cultures, ressusciter des espèces disparues ou donner vie à des bébés parfaits : grâce à leur simplicité déconcertante, les ciseaux génétiques CRISPR-Cas9 ont donné des idées aux scientifiques dans le monde entier.

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[EN VIDÉO] Interview : la génétique pourrait-elle inverser le vieillissement ? Ralentir le vieillissement, voire l’inverser, voilà ce que pourrait offrir la génétique dans les années à venir. Mais où en est actuellement la recherche sur ce sujet ? Futura-Sciences a interviewé Vera Gorbunova, chercheuse en biologie, lors de son allocution à TEDxCannes, afin d’en savoir plus. 

Mise au point en 2012 par Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 a révolutionné l’édition génétique en permettant d’insérer et d’éditer très facilement des gènes dans une chaîne ADN. Contrairement aux modifications génétiques classiques, qui nécessitent des manipulations complexes et laborieuses, CRISPR est peu coûteux, fonctionne avec pratiquement tous les types d’organismes et peut s’appliquer à grande échelle. Des avantages qui ont ouvert la voie à toute une série d’applications en santé, agronomie ou environnement.

Créer des moustiques anti-paludisme

Lutter contre le paludisme en éliminant les moustiques vecteurs de la maladie : tel était le but de l’expérimentation menée en août 2018, autour du village de Pala, à l’ouest du Burkina Faso, où 10.000 moustiques génétiquement programmés pour être stériles ont été relâchés. D’autres essais ont été menés cherchant à rendre le moustique résistant au plasmodium, le parasite responsable du paludisme, ou à propager un gène de stérilité aboutissant à l’extinction des populations (forçage génétique). Lors d’une expérience menée en 2018, une équipe menée par Andrea Crisanti et Tony Nolan, les pionniers de cette technique, est ainsi parvenue à engendrer une totale disparition en 7 générations.

Illustration - Le moustique est responsable de nombreuses maladies. © Roman, iNaturalist 

Concevoir des bébés « améliorés »

En novembre 2018, le chercheur chinois He Jiankui a annoncé avoir donné naissance au premier bébé génétiquement modifié pour l’immuniser contre le virus du sida en désactivant un gène appelé CCR5. Une mutation qui améliorerait également les fonctions cognitives. Si cette première mondiale a valu à He Jiankui une mise au ban par l’ensemble de la communauté scientifique internationale et un procès, elle a ouvert la voie à un débat sur les manipulations génétiques visant à améliorer l’être humain. D’un côté, des couples porteurs d’une maladie transmissible pourraient donner naissance à des bébés sains. De l’autre côté, cela ouvre la porte à des dérives eugéniques, comme la création d’athlètes hors du commun ou d’êtres supérieurement intelligents.

Inventer des « super animaux » d’élevage

Alison Van Eenennaam, chercheuse à l’Université de Californie, a réussi en 2018 à insérer le gène SRY dans le génome de vaches femelles afin de les transformer en mâles. De quoi créer des troupeaux 100 % masculins, avec des animaux ayant une croissance plus rapide et dotés de plus de masse musculaire. D’autres chercheurs espèrent rendre la viande plus tendre en inhibant le gène de la calpastatine qui dégrade les fibres musculaires post-mortem. Également à l’étude : des vaches tolérantes à la chaleur ou résistantes à la tuberculose, des porcelets naturellement castrés, ou encore des poulets immunisés contre la grippe aviaire, ce qui permettrait d’éviter l’utilisation d’antibiotiques dans les élevages.

Illustration - Des cheptels 100 % mâles grâce à CRISPR. © Petras Gagilas, Flickr 

Ressusciter des espèces disparues

Redonner vie au mammouth, au tigre de Tasmanie ou à l’auroch ? Un vieux rêve de scientifique mais qui se rapproche un peu plus de la réalité grâce à CRISPR-Cas9. George Church, généticien à la Harvard Medical School de Boston, espère ainsi pouvoir recréer un ersatz de mammouth en insérant des gènes d’un spécimen congelé dans le génome d’un éléphant indien, l’espèce la plus proche. Ben Novak, de l’association Revive & Restore, ambitionne de ressusciter le pigeon voyageur, éteint à la fin du XIXe siècle, en intégrant d’anciens gènes chez le pigeon moderne. Les premiers oiseaux dotés d’un génome contenant l’enzyme Cas9 (permettant ensuite l’utilisation de CRISPR), sont nés fin 2018.

Cultiver des organes humains chez des cochons

Chaque année, plus de 20.000 personnes sont en attente d’un greffon en France. Pour parer à la pénurie, les scientifiques espèrent bientôt pouvoir transplanter chez l’Homme des organes de porc modifiés pour accroître leur compatibilité. En décembre 2018, un babouin a ainsi survécu six mois avec un coeur de cochon, dont plusieurs gènes avait été modifiés grâce à CRISPR. La start-up américaine eGenesis planche de son côté sur des cellules de porcs dont le système immunitaire a été affaibli, et qui sont dépourvues d’une partie du génome porteur d’un virus dangereux pour l’Homme. Cœur, pancréas, foie, cornée ou peau : le porc va-t-il se transformer en banque d’organes sur pattes ?

Illustration - Des organes humains cultivés chez les cochons génétiquement modifiés. © labitase, Fotolia 

Soigner les maladies

CRISPR permet à la thérapie génique de prendre un nouvel envol. En 2016, des chercheurs chinois sont parvenus à des injecter des lymphocytes T génétiquement modifiés chez un patient atteint d’un cancer du poumon afin que ces derniers reconnaissent et attaquent les cellules tumorales. D’autres chercheurs misent sur CRISPR pour freiner la division des cellules cancéreuses. Les maladies rares sont bien sûr une autre cible privilégiée, par exemple pour corriger les erreurs dans le génome des personnes atteintes de la dystrophie musculaire de Duchenne. Des chercheurs de l’Inserm ont, quant à eux, réussi à réactiver un gène de globine-γ afin de supprimer des anomalies de l’hémoglobine absente ou malformée chez des patients atteints de drépanocytose ou de béta-thalassémie.

Illustration - La thérapie génique par CRISPR. © Connect world, Fotolia 

Doper les plantes et améliorer leurs qualités

En modifiant les plantes sans y intégrer de gène étranger, CRISPR pourrait révolutionner l’amélioration variétale tout en évitant le recours aux OGM. Une équipe de l’Université Purdue et de l’Académie des Sciences de la Chine a ainsi développé une variété de riz produisant 25 % à 35 % de grains en plus. En Espagne, le biologiste Francisco Barro utilise CRISPR pour éliminer les gènes du blé responsables des gliadines, les protéines du gluten à l’origine de la maladie cœliaque. Sont aussi sur les rangs, du maïs résistant à la sécheresse, des champignons qui ne brunissent pas ou des tomates naturelles pimentées. CRISPR pourrait aussi amener dans nos assiettes de nouveaux fruits sauvages, rendus comestibles et commercialement rentables.

Produire du biocarburant

Certaines microalgues ou cyanobactéries transforment naturellement le CO2 en sucres et lipides utilisables pour la fabrication de biocarburant. Grâce à CRISPR-Cas9, les chercheurs espèrent optimiser leur métabolisme de façon à doper leur rendement. Des scientifiques de Taïwan sont ainsi parvenus à doper la production de lipides de 94 % chez Chlamydomonas reinhardtii, une algue verte microscopique, en modulant l’expression d’un gène régulant la fixation du carbone. Des microalgues ou levures génétiquement modifiées permettront aussi de produire des précurseurs de vitamines, de pigments, de protéines, des biopolymères pour la fabrication de plastique ou encore des molécules pour l’industrie pharmaceutique.

Illustration - Des microalgues génétiquement modifiées pour produire du bioarburant. © GiroScience, Fotolia 

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©2001-2022 Futura-Sciences, tous droits réservés - Groupe MadeInFutura – Source : https://www.futura-sciences.com/sante/questions-reponses/crispr-cas9-crispr-8-applications-edition-genetique-12228/

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  • Édition génomique des plantes : SpRY, un nouveau ciseau moléculaire plus universel - 01 mai 2021 – Document ‘Perspectives Agricoles’
    Une variation, dite SpRY, de l’outil d’édition génomique CRISPR-Cas9 permet de modifier un gène virtuellement n’importe où - une aubaine pour la recherche. Décryptage. 01 mai 2021 - Illustration

Développée ces dernières années, l’édition génomique(1) est un procédé visant à modifier une séquence génétique, c’est-à-dire une partie d’un gène. Les outils moléculaires d’édition sont tous basés sur le même principe : la coupure des deux brins de l’ADN par une enzyme spécifique (un complexe de protéines appelées nucléase), qui est suivie d’une réparation nécessaire à la viabilité des cellules.

Selon le mécanisme de réparation à l’œuvre, la réparation de l’ADN(2) peut être parfaite, ce qui ne conduit alors à aucune modification du génome, ou produire une altération de l’ADN : soit la séquence coupée est « perdue » (délétion), soit une séquence différente de l’originale s’insère au site de la coupure (insertion). Dans les deux cas, le gène est modifié (mutation). Le type de mutation reste largement aléatoire.

Lorsqu’on souhaite modifier un gène en un site précis, il faut tout d’abord connaître la séquence génétique visée par la modification et disposer d’une nucléase qui cible cette séquence. À ce jour, il y a trois types de nucléases, d’où trois outils moléculaires différents d’édition génomique : les CRISPR, les ZFN et les TALEN.

Illustration

Toaster son pain à moindre risque Une bonne nouvelle pour les amateurs inconditionnels de pain grillé ou de baguette bien cuite. Des chercheurs de l’institut Rothamsted (Grande-Bretagne) ont utilisé les ciseaux moléculaires CRISPR-Cas9 pour modifier le génome du blé afin qu’il ait moins de chance de former de l’acrylamide à la cuisson. Ce composé, partie prenante de l’arôme et de la saveur du pain mais suspecté d’être cancérogène, se forme quand l’asparagine contenu dans la farine est portée à haute température : plus le pain est brun ou le toast grillé, plus il contient d’acrylamide et ce, d’autant plus que le grain était riche en asparagine. CRISPR-Cas9 a été utilisé pour « éteindre » le gène TaASN2 qui synthétise l’asparagine. Chez les blés au génome modifié, la concentration en asparagine dans le grain est considérablement réduite par rapport aux variétés classiques : jusqu’à 90 % en moins dans une des lignées modifiées. Les coordinateurs du projet indiquent qu’il faut encore valider ces résultats par des essais au champ avant de délivrer ce matériel génétique aux sélectionneurs. Il faudra 5 à 10 ans avant que des blés à faible teneur en asparagine arrivent sur le marché.

CRISPR-Cas, l’outil de prédilection

Décrit pour la première fois en 2012, le système CRISPR-Cas est, à l’origine, un mécanisme de défense immunitaire des bactéries et des archées contre les infections virales ; il fragmente les brins d’ADN envahisseurs pour les rendre inopérants. CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) est une séquence présente dans le génome des bactéries qui contient plusieurs motifs répétés entrecoupés de fragments d’ADN étranger (spacers) ; en cas d’infection virale, les spacers sont utilisés afin de produire des ARN CRISPR qui s’associent à leur tour à un ARN transactivateur et permettent de cibler les séquences de virus reconnus par la cellule hôte. Ce complexe d’ARN guidera précisément l’enzyme Cas (associée à CRISPR) jusqu’à l’ADN envahisseur afin de le détruire. On peut ainsi y voir une analogie avec le système immunitaire des mammifères.

Ce complexe d’ARN possède une séquence d’ADN complémentaire(3) de l’ARN CRISPR (dite protospacer), immédiatement suivie d’un motif de quelques nucléotides appelé PAM (protospacer adjacent motif). La présence de ce motif PAM permet au complexe CRISPR-Cas d’identifier rapidement la séquence-cible et de procéder à la coupure pour inactiver l’envahisseur.

Ce système de défense bactérien a été mis à profit pour en faire un ciseau où l’envahisseur est désormais la séquence à modifier. L’ARN CRISPR et l’ARN transactivateur ont été fusionnés en laboratoire en un « ARN-guide » artificiel comprenant une séquence de reconnaissance de 20 nucléotides, modifiable afin de cibler dans un génome pratiquement n’importe quel gène d’intérêt (en place de l’ADN envahisseur). Cet ARN-guide est associé à la nucléase Cas9, issue de la bactérie Streptococcus pyogenes et optimisée (notée SpCas9) ; il permet au système CRISPR-Cas9 d’être exprimé dans les cellules de tout organisme vivant, et notamment des plantes (schéma).

CRISPR-Cas9 : plus facile à utiliser mais pas « universel »

Photo

Comparé aux deux autres types d’outils moléculaires existants, le système CRISPR-Cas9 est beaucoup plus simple et plus facile à adapter à une cible donnée. En effet, la protéine « ciseau » CRISPR demeure toujours la même, seul l’ARN-guide change. Les 20 nucléotides de ce dernier sont choisis et arrangés sur ordinateur selon la cible visée, puis synthétisés par les fournisseurs de réactifs moléculaires. De plus, ce système permet de viser (et donc de modifier) plus d’une cible à la fois si l’on fusionne plusieurs séquences de 20 nucléotides espacées par des répétitions directes comme celles retrouvées dans le locus CRISPR des bactéries.

Toutefois, les actions des enzymes des outils CRISPR-Cas9 sont restreintes aux régions du génome riches en « motifs » PAM, qui précèdent la région cible et qui sont spécifiques à chaque enzyme Cas. Le motif PAM doit être présent sur le brin d’ADN ciblé. La coupure franche sur le brin ciblé survient trois nucléotides en amont du motif PAM.

Le PAM originel, dit « canonique », associé à la protéine Cas9 issue de S. pyrogenes, contient la séquence NGG, où N peut être n’importe quel nucléotide A, T, G ou C. Mais d’autres PAMs peuvent être associés aux protéines Cas9, issus d’autres bactéries telles que Neisseria meningitidis, Treponema denticola ou Streptococcus thermophilus.

Plusieurs tentatives ont été menées pour construire des Cas9 capables de reconnaître d’autres PAMs, afin d’améliorer la capacité d’éditer n’importe quelle zone du génome avec les ciseaux CRISPR-Cas9. Par exemple, le Cas9 de la bactérie Francisella novicida, qui reconnaît le PAM « canonique », a été modifié pour reconnaître une séquence YG (ou Y désigne une pyrimidine), ce qui accroît les cibles possibles de Cas9.

SpRY élargit considérablement les cibles possibles

Récemment, une nouvelle classe d’outils moléculaires dits SpRY(4), également dérivés de la protéine Cas9 de S. pyrogenes, a été développée. Celle-ci semble beaucoup moins spécifique vis-à-vis des motifs PAM. Les SpRY diffèrent des Cas9 par onze nucléotides et sont capables de détecter des motifs de type NAN, NTC, NCT, NCC et NCG. Cela ouvre la possibilité d’éditer des régions jusque-là inaccessibles, comme l’a montré une équipe chinoise notamment sur le riz.

L’outil SpRY est en passe d’être testé sur d’autres espèces végétales afin d’évaluer sa puissance et sa précision. Ces nouvelles études préciseront en particulier le taux d’éditions produites hors cible, qui ont déjà été mises en évidence par l’étude chinoise. En effet, la spécificité des ARN-guide (prérequis à CRISPR) peut conduire à des mutations hors cible, notamment dans les génomes ayant beaucoup de séquences répétées ou dans les génomes polyploïdes comme le blé. Il faudra donc construire des ARN-guides très spécifiques afin d’éviter ces éditions génomiques indésirées et inclure une procédure supplémentaire de criblage pour écarter des schémas de sélection les plantes présentant des mutations hors cible.

(1) Séquence génétique : les gènes sont constitués de quatre sortes de nucléotides : adénine (A), guanine (G), cytosine (C), et thymine (T). Dans les gènes, les nucléotides forment des suites ordonnées, appelées séquences - par exemple, AATGTCA -, aux fonctions spécifiques. Deux séquences sont dites complémentaires si, à chaque nucléotide de l’une, correspond le nucléotide complémentaire dans l’autre : G au lieu de C, C au lieu de G, A au lieu de T, et T au lieu de A.

(2) Séquence d’ARN : (acide ribonucléique). C’est un enchainement dit « simple brin » de quatre nucléotides possibles : A, G, C et U (uracile).

(3)Séquence d’ADN : (acide désoxyribonucléique) « Double brin », elle est formée de deux enchainements des nucléotides A, G, C et T. Les deux brins sont appariés, l’un des brins étant formé des nucléotides complémentaires de l’autre brin (G au lieu de C, C au lieu de G, A au lieu de T, et T au lieu de A).

(4) D’après les articles de L. Hille et B. Kelinstiver, « Plant genome editing branches out » et de Qiurong Ren et al., « PAM-less plant genome editing using a CRISPR–SpRY toolbox », parus en janvier 2021 dans Nature.

Paloma Cabeza-Orcel - p.cabeza@perspectives-agricoles.com
En collaboration avec Matthieu Bogard & Delphine Hourcade (ARVALIS)

Sur le même sujet : Génétique : l’édition du génome avec CRISPR/Cas9

Mots-clés : PAM sélection génétique séquence

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Perspectives Agricoles n°477 | Ecophytopic

Source : https://www.perspectives-agricoles.com/edition-genomique-des-plantes-spry-un-nouveau-ciseau-moleculaire-plus-universel-@/view-3699-arvarticlepa.html

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  • Une nouvelle technique d’édition génétique pourrait faire mieux que les ciseaux CRISPR  : « Un outil d’édition génétique plus simple et plus flexible » - Mis à jour le 03 mai 2021 à 12h42 – Par Marcus Dupont-Besnard
    Une nouvelle technique d’édition génétique, basée sur les retrons, pourrait éviter les dommages collatéraux potentiels provoqués par les ciseaux génétiques CRISPR.

La technique CRISPR a révolutionné l’édition génétique lors de sa création en 2012. Ce sont des « ciseaux génétiques » : à partir d’une protéine, il est possible d’éditer des parties de l’ADN, modifiant alors le patrimoine génétique. Cela ouvre la voie à de nombreux usages médicaux utiles, par exemple contre le cancer. Mais cet outil a certaines limites, notamment un manque de précision. Dans un article de recherche à paraitre le 4 mai 2021 dansPNAS, un groupe de huit chercheurs, notamment affiliés au Wyss Institut de Harvard, décrivent une nouvelle technique d’édition génétique.

Ce nouvel outil repose sur les retrons. Comment fonctionne-t-il ? Peut-il s’avérer plus efficace que CRISPR ?

Éviter les dommages collatéraux des « ciseaux génétiques »

Pour éditer le génome, CRISPR repose sur l’enzyme Cas9, accompagnée par de l’ARN servant de guide. Par ce biais, on induit des cassures dans le double brin d’ADN. Ces cassures permettent de modifier le gène ciblé, ou même de réduire ou augmenter son expression. De ce principe est tirée la dénomination de « ciseaux génétiques », car il s’agit en réalité de découper l’ADN.

Toutefois, pour modifier l’ADN afin d’y intégrer les mutations souhaitées, «  il faut inciter la cellule à utiliser un nouveau morceau d’ADN pour réparer la cassure », explique le groupe de chercheurs récemment publié dans PNAS. « Ce processus d’amorçage peut être compliqué à orchestrer et peut même s’avérer toxique pour les cellules, car Cas9 [l’enzyme utilisée] coupe souvent des sites non intentionnels, hors cible. » Ces dommages collatéraux sont un problème.

Pour aller plus loin : La co-créatrice de CRISPR demande un meilleur encadrement du « ciseau génétique »

Pour cette raison, ces chercheurs ont développé une technique qu’ils appellent Retron Library Recombineering (RLR), et qui se repose sur les retrons, des séquences génétiques que l’on retrouve dans certaines bactéries et qui produisent un brin d’ADN simple et unique. La différence majeure avec CRISPR : cela consiste à introduire un morceau d’ADN dans une cellule lors de la phase où celle-ci réplique son génome. Cela permet d’éviter de casser l’ADN, en surfant sur un processus génétique naturel.

En clair :

  • Dans l’usage de CRISPR, on casse physiquement l’ADN à double brin pour inciter la cellule à incorporer la mutation voulue (portée par l’enzyme Cas9) durant le processus de réparation ;
  • Avec la technique RLR présentée dans cette étude, on introduit une mutation sous la forme d’un brin d’ADN au moment de la réplication de la cellule, de sorte que les cellules sœurs qui en découlent répliquent ensuite cette mutation naturellement. Utiliser les retrons permet donc de « produire de l’ADN simple brin à l’intérieur des cellules que nous voulions modifier, plutôt que d’essayer de les forcer à entrer dans la cellule de l’extérieur, et sans endommager l’ADN natif, deux qualités très convaincantes ».
    Un outil « plus simple et plus flexible » que les ciseaux CRISPR

La technique basée sur les retrons a donc pour avantage majeur de ne pas endommager l’ADN, évitant les dommages collatéraux des ciseaux génétiques CRISPR. Par ailleurs, la séquence génétique des retrons peut faire office de « code-barre » permettant de les identifier. Ce niveau de précision offre aux chercheurs la possibilité de procéder à de l’édition génétique sur un groupe de plusieurs cibles dans lesquelles on veut insérer des mutations. Pour les recherches, cela sert à «  réaliser des millions d’expériences simultanément, ce qui nous permet d’observer les effets des mutations sur l’ensemble du génome, ainsi que la façon dont ces mutations peuvent interagir entre elles ».

Les auteurs en concluent que la RLR est «  un outil d’édition génétique plus simple et plus flexible », qui peut être utilisé pour des expériences à plusieurs, tout en éliminant « la toxicité souvent observée avec CRISPR » et en améliorant « la capacité des chercheurs à explorer les mutations au niveau du génome ». Le groupe de recherche estime que cette technique pourrait être combinée avec CRISPR, ou tout simplement servir de remplacement dans les situations où les ciseaux génétiques de CRISPR sont réputés être risqués.

Cette technique basée sur les retrons n’est pas la première innovation se présentant comme une alternative à CRISPR pour l’édition génétique. En octobre 2019, des généticiens avaient présenté, dans Nature, le prime editing. Là encore, il s’agit d’éviter les effets délétères de la découpe : cette technique vise à simplement entailler l’ADN pour réécrire son code.

Pour aller plus loin : Prime editing : pourquoi cette nouvelle technique de modification génétique pourrait remplacer CRISPR

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Source : https://www.numerama.com/sciences/708500-une-nouvelle-technique-dedition-genetique-pourrait-faire-mieux-que-les-ciseaux-crispr.html

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6.
Présentation scientifique du Retron - Article de « Wikipedia, the free encyclopedia’ » – Traduction du 30/01/2022 par Jacques Hallard

Un retron est une séquence d’ADN distincte présente dans le génome de nombreuses espèces de bactéries qui code pour la transcriptase inverse et un hybride ADN/ARN monocaténaire unique appelé ADN monocaténaire multicopie (msDNA). L’ARN msr de retron est l’ARN non codant produit par les éléments retron et il est le précurseur immédiat de la synthèse de l’ADNm. L’ARNm retron se replie en une structure secondaire caractéristique qui contient un résidu guanosine conservé à l’extrémité d’une boucle de tige. La synthèse de l’ADN par la transcriptase inverse (TI) codée par le retron produit une chimère ADN/ARN composée d’un petit ADN simple brin lié à un petit ARN simple brin. Le brin d’ARN est joint à l’extrémité 5′ de la chaîne d’ADN via une liaison phosphodiester 2′-5′ qui se produit à partir de la position 2′ du résidu guanosine interne conservé.

L’opéron retron porte une séquence promotrice P qui contrôle la synthèse d’un transcrit ARN portant trois loci : msr, msd, et ret. Le produit du gène ret, une transcriptase inverse, transforme la partie msd/msr du transcrit ARN en ADNm.

Les éléments retron ont une longueur d’environ 2 kb. Ils contiennent un seul opéron contrôlant la synthèse d’un transcrit d’ARN portant trois loci, msr, msd, et ret, qui sont impliqués dans la synthèse du msDNA. La partie ADN du msDNA est codée par le gène msd, la partie ARN est codée par le gène msr, tandis que le produit du gène ret est une transcriptase inverse similaire aux RT produites par les rétrovirus et d’autres types de rétroéléments. Comme les autres transcriptases inverses, la RT du retron contient sept régions d’acides aminés conservées (marquées 1-7 dans la figure), y compris une séquence très conservée tyr-ala-asp-asp (YADD) associée au noyau catalytique. Le produit du gène ret est responsable de la transformation de la partie msd/msr de la transcription de l’ARN en ADNm.

Pendant de nombreuses années après leur découverte dans les virus animaux, on a cru que les transcriptases inverses étaient absentes des procaryotes. Actuellement, cependant, des éléments codant pour les RT, c’est-à-dire des rétroéléments, ont été découverts dans une grande variété de bactéries différentes :

  • Les rétrons ont été la première famille de rétroéléments découverte chez les bactéries ; les deux autres familles de rétroéléments bactériens connues sont :
  • Les introns du groupe II : Les introns du groupe II sont les rétroéléments bactériens les mieux caractérisés et le seul type connu pour présenter une mobilité autonome ; ils consistent en un RT codé à l’intérieur d’une structure d’ARN catalytique et auto-épissée. La mobilité des introns du groupe II est médiée par une ribonucléoprotéine comprenant un lariat d’intron lié à deux protéines codées par l’intron.
  • Les rétroéléments générateurs de diversité (DGR). Les DGR ne sont pas mobiles, mais ils ont pour fonction de diversifier les séquences d’ADN. Par exemple, les DGR assurent la médiation du passage entre les phases pathogènes et libres de Bordetella.
    Comme les retrons ne sont pas mobiles, leur apparition dans diverses espèces bactériennes n’est pas un phénomène d’’ADN égoïste’. Au contraire, les retrons doivent conférer un certain avantage sélectif à l’organisme hôte. On ignore quel peut être cet avantage. À l’exception de la production d’ADNm, aucun phénotype clair ne leur a été associé. Malgré des recherches considérables, on sait très peu de choses sur la fonction de l’ADNm, la mobilité des éléments retrons ou leur effet sur la cellule hôte. Cependant, des preuves récentes suggèrent qu’ils jouent un rôle dans la prévention de la propagation des bactériophages dans une population.

Les éléments retrons sont en cours de développement pour devenir des outils d’édition du génome…

Structure secondaire prédite et conservation de la séquence du Retron msr ARN 

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Lire l’article complet en anglais avec les notes et références sur ce site : https://en.wikipedia.org/wiki/Retron

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Pour consulter les articles étiquetés « CRISPR Edition gènes génomique du génome » postés sur ISIAS, se reporter à ce site : https://isias.lautre.net/spip.php?page=recherche&recherche=CRISPR+Edition+g%C3%A8nes+g%C3%A9nomique+du+g%C3%A9nome

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Collecte des documents et arrangement, traductions et intégration de liens hypertextes par Jacques HALLARD, Ingénieur CNAM, consultant indépendant – 30/02/2022

Site ISIAS = Introduire les Sciences et les Intégrer dans des Alternatives Sociétales

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Fichier : ISIAS Génétique CRISPR Méthodes de sélection comparées Outils annoncés comme prometteurs SpRY et retron.6.docx

Mis en ligne par le co-rédacteur Pascal Paquin du site inter-associatif, coopératif, gratuit, sans publicité, indépendant de tout parti, géré par Yonne Lautre : https://yonnelautre.fr - Pour s’inscrire à nos lettres d’info > https://yonnelautre.fr/spip.php?breve103

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