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"De la soie d’araignée produite par les méthodes et techniques du génie génétique" par le Dr Mae-Wan Ho

Traduction et compléments de Jacques Hallard
vendredi 4 janvier 2013 par Ho Dr Mae-Wan

ISIS Biologie Araignées
De la soie d’araignée produite par les méthodes et techniques du génie génétique
Genetic Engineering Spider Silk
De la soie d’araignée peut être produite à partir de protéines recombinantes en toute sécurité et de manière efficace, soit en cultivant des bactéries recombinées, soit en élevant des vers à soie génétiquement modifiés [OGM] : mais pour cela, un confinement strict peut et doit être mis en œuvre. D’après le Dr Mae-Wan Ho

Rapport de l’ISIS en date du 19/03/2012
Une version entièrement illustrée et référencée de cet article, intitulé Genetic Engineering Spider Silk, est postée et accessible par les membres de l’ISIS sur le site suivant http://www.i-sis.org.uk/Genetic_Eng...
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  Les utilisations de la soie d’araignée

Les applications potentielles de la soie d’araignée sont légion en raison de sa combinaison unique de propriétés mécaniques associées à la beauté chatoyante de la fibre naturelle (voir [1] In Praise of Spiders et soie d’araignée , SiS 54) *.
* Version en français "Un éloge des araignées et de la soie d’araignée" par le Dr Mae-Wan Ho. Traduction et compléments de Jacques Hallard ; accessible sur http://isias.transition89.lautre.ne...
La soie d’araignée est plus solide et plus résistante que l’acier, tout en restant encore flexible et extensible, ce qui en fait actuellement le matériel disponible avec les meilleures propriétés mécaniques, d’où son utilisation pour fabriquer des gilets pare-balles : cette nouvelle a fait les titres de nombreuses publications (voir [2] Unspinning the Web of the Spider Goat, SiS 54) **.
** Version en français "Méfions-nous de la toile de la ‘chèvre-araignée’" par le Dr. Mae-Wan Ho. Traduction et compléments de Jacques Hallard. Accessible sur http://isias.transition89.lautre.ne...
Non seulement la soie d’araignée fournit de nouvelles fibres pour les textiles et pour une multitude d’autres usages, mais encore elle est idéale pour une utilisation comme fil de suture chirurgicale, comme base de squelette pour aider à régénérer les os et la peau dans les cultures cellulaires pendant le remplacement des tissus, mais aussi sous forme de capsules pour délivrer des médicaments, pour des dispositifs d’états solides, pour les films de biodétection [3], pour des cordes de parachutes et des matériaux composites utilisés dans les avions [4].
Mais, comme les araignées sont très difficiles à élever, une grande partie des efforts ont été consacrés à la production de la soie d’araignée par les méthodes et techniques du génie génétique.
Il y a des défis majeurs dans la production de la soie d’araignée par génie génétique. Premièrement, les modules répétitifs du gène de soie d’araignée [1] tendent à devenir tronqués dans l’hôte transgénique, par recombinaison entre les modules répétés du même gène. Deuxièmement, le contenu élevé en glycine (43-45%) fait peser une charge inhabituelle sur la machinerie de traduction de la cellule hôte [3]. Et même après que la protéine de soie parfaite soit produite, le plus grand obstacle rencontré est de filer la fibre d’une manière aussi proche que ce que l’araignée file naturellement avec la plus grande facilité.
Néanmoins, le caractère répétitif du noyau protéique offre des possibilités pour créer des gènes synthétiques qui pourraient modifier et adapter les propriétés mécaniques de la soie pour des applications spécifiques.

  Les plus longues molécules de soie d’araignée provenant d’ingénierie génétique sont produites à des niveaux élevés dans la bactérie E. coli qui a été génétiquement modifiée (ou recombinée)

Parmi les tentatives les plus réussies à ce jour, on relève la production de la soie d’araignée génétiquement modifiée dans les bactéries E. coli.
Les chercheurs d’un groupe dirigé par San Yup Lee de l’Institut Supérieur des Sciences et de la Technologie, à Daejeon en Corée, ont réussi à produire les plus grosses protéines de soie d’araignée dans E. coli. Le record est la soie de Nephila clavipes (une espèce d’araignée) recombinante d’une quantité de 284,9 kDa, qui a été produite et filée avec une fibre présentant des propriétés mécaniques "comparables" à celles de la soie d’origine naturelle. La protéine riche en glycine est avantageusement exprimée métaboliquement dans une souche issue d’ingénierie génétique, avec un ensemble amélioré de glycyl-ARNt, l’ARN de transfert de la glycine chargé en acide aminé et prêt à être ajouté à la chaîne protéique en croissance de la soie d’araignée.
La grande protéine produite est importante quantitativement, car les petites protéines ont donné des fibres de soie de qualité inférieure, et l’enrichissement en glycyl-ARNt a stimulé la production de protéines de soie à des niveaux élevés.
Les chercheurs ont utilisé des versions synthétiques de la spidroïne sérigène principale de type 1 (MASP1) [1] contenant un nombre différent de modules de répétition, s’étendant de 32 à 96, avec des poids moléculaires prédits de 100,7 à 284,9 kDa, la plus grande étant de même masse moléculaire que la MaSp2 naturelle qui se trouve dans la glande de la soie de l’araignée.
Pour savoir comment l’expression des gènes de la soie affecte les protéines de l’hôte, les chercheurs ont effectué une analyse protéomique, ce qui donne un profil du niveau d’expression de toutes les protéines dans la cellule. Beaucoup de protéines de réponse au stress ont été régulées à la hausse. Surtout, l’enzyme qui synthétise la glycine - sérine hydroxyméthyltransférase (glyA) - et la sous-unité B (GlyS) de l’enzyme qui synthétise glycyl-ARNt, étaient simultanément régulées à la hausse, ce qui suggère une demande accrue de glycyl-ARN dans l’expression de la protéine riche en glycine.
Une augmentation de la dose du gène de la glycyl-ARNt synthétase n’a pas amélioré la production de la soie. Ainsi, il a été décidé d’augmenter le pool de glycyl-ARNt en surexprimant les gènes codant pour les ARNt dans un plasmide. Il en est résulté une expression plus élevée des quatre plus grosses protéines de soie d’araignée (48-96-mer), et dans tous les cas, une croissance cellulaire accrue de 30-50%. Les niveaux d’expression des deux plus grandes protéines principales (80-96-mer) ont été encore accrus par la duplication de la cassette d’expression glycyl-ARNt. En outre, l’enzyme de biosynthèse de la glycine, glyA était surexprimée, ce qui a encore accru les niveaux des trois plus grosses protéines. Les deux modifications agissent de manière synergique, et elles ont permis ensemble une production de 10 à 35 fois plus élevée des trois plus grandes protéines de soie d’araignée.
Les souches bactériennes peuvent être cultivées à des densités cellulaires élevées, de plus de 42 g / litre, avec un maximum de concentration de protéines de soie estimée dans la gamme de 0,5 à 2,7 g / litre (estimations minimales).
Les cellules ont été collectées à partir d’un litre de culture, et lysées (éclatées). De l’acide a été ajouté à la suspension, ce qui l’a débarrassé de la plupart des protéines cellulaires contaminantes, car les protéines de soie sont très chargées positivement, et donc solubles dans l’acide. Puis une précipitation fractionnée au sulfate d’ammonium a encore enrichi et purifié la protéine de soie. D’autres étapes ont finalement abouti à produire 1,2 g de la protéine de soie, avec une pureté d’environ 90%.

  Les fibres filées de la bactérie recombinée sont comparables à celles des fibres naturelles d’araignée.

Les fibres sont filées à partir de toutes les protéines différentes, y compris une protéine 16-mer de 54,6 kDa, sous les mêmes conditions de filature et de motif, après dissolution dans l’hexafluoroisopropanol à une concentration de 20% (poids / volume).
Les propriétés mécaniques d’une fibre [1] sont les mieux décrites sous la forme d’une courbe de déformation sous contrainte lorsque la fibre est étirée. La hauteur maximum de la courbe de déformation sous contrainte est appelée tenue ou ténacité, la quantité de stress qu’une fibre peut prendre avant d’être déchirée. La mesure horizontale la plus éloignée de la courbe de déformation sous contrainte est le point de rupture, représentant l’extensibilité de la fibre. Le rapport de la contrainte à la rupture est le module de Young, qui est dérivé par la pente de la courbe en tant que mesure de la rigidité de la fibre.
La fibre 96-mer a présenté une ténacité de 508 + 108 MPa et un allongement de 15 + 5%, qui sont comparables aux valeurs rapportées pour la soie dragline naturelle de N. clavipes : de 740 à 1 200 MPa ; 18-27%. Notamment, le module de Young de la fibre 96-mer était de 21 + 4 GPa, soit le double de la mesure effectuée sur la soie dragline naturelle : 11-14 GPa.
Auparavant, une protéine de soie dragline recombinante de 60 kDa de l’araignée Araneus diadematus avait été filée avec une fibre ayant une ténacité moyenne d’environ 260 MPa, soit 4,2 fois inférieure à celle de la soie naturelle à 1.100 MPa, probablement en raison de la petite taille de la protéine recombinante. La ténacité de la fibre 96-mer (508 + 108 MPa) est la plus élevée jamais enregistrée pour des protéines recombinantes de soie d’araignée (voir Figure 1).
Figure 1 : Analyse de fibres filées à partir de protéines recombinantes de soie ; a, Courbes typiques de déformation sous contrainte ds fibres 16-mer (bleue), 32-mer (rouge), 64-mer (verte) et 96-mer (violette), d’après l’analyse au Xia et al, 2011 [4]
L’analyse en microscopie électronique à balayage, de la surface de la fibre a révélé une structure fibrillaire dans toutes les fibres, comme pour la soie d’araignée dragline naturelle. L’analyse des fibres fracturées a montré de nombreux vides irréguliers dans les fibres les plus courtes, alors que ces défauts étaient absents dans les fibres de 64-mer et 96-mer ; ce qui laisse supposer que les protéines de soie les plus longues donnent les fibres les plus solides (Figure 2).
Figure 2 - Microscopie électronique à balayage des fibres filées à partir (de gauche à droite) des protéines 16-mer, 32-mer, 64-mer et 96-mer ; partie supérieure : surface des fibres ; milieu et partie inférieure : surface fracturée, échelle : barre supérieure et mlieu 10 mm, barre inférieure 1 mm, à partir de Xia et al, 2011 [4]
Le système bactérien E. coli a un grand avantage du fait que le génome bactérien est bien caractérisé et bien compris, et qu’il peut être manipulé très précisément. Il est très prometteur pour la production d’une soie d’araignée de bonne qualité, de manière efficace et en toute sécurité dans des conditions strictement contenues et confinées. Un inconvénient réside dans le fait que ce système bactérien ne peut pas produire de la fibre de soie sous une forme prête à être filée.

  La soie d’araignée hybride à partir des vers à soie

Le ver à soie Bombyx mori est un autre hôte prometteur pour la production de soie d’araignée. Une limitation importante pour la production de soie d’araignée de bonne qualité réside dans le procédé de filage que permettent les fibres provenant des protéines de soie.
Le vers à soie transgénique peut potentiellement produire des fibres recombinantes de soie d’araignée sous une forme prête à être filée, à condition que la protéine de soie d’araignée soit ciblée sur la glande à soie du ver, avec un promoteur spécifique du tissu.
Une équipe de chercheurs dirigée par Donald Jarvis, de l’Université du Wyoming, à Laramie, aux Etats-Unis, a utilisé le vecteur d’insectes PiggyBac pour transformer, pour modifier génétiquement les vers à soie, avec un gène de soie d’araignée synthétique contenant 14 répétitions d’un module contenant (A)8. (GPGGA)8, où A représente l’alanine, G la glycine, et P la proline. Les répétitions ont été jointes à des peptides terminaux C- et N- du gène de la chaîne lourde fibroïne du ver à soie, et placé sous le contrôle du promoteur de la chaîne lourde fibroïne et des séquences activatrices. La construction a été conçue pour produire de la soie hybride d’araignée et de ver à soie qui peut être isolée à partir du cocon du ver à soie.
Dans une autre version du vecteur, la séquence de soie d’araignée a également été jointe à un gène de la protéine fluorescente verte pour aider à identifier les soies et les vers transgéniques. Les vers à soie transgéniques ont été produits et ceux qui possèdaient la protéine fluorescente verte ont été facilement identifiables par une inspection visuelle des cocons ainsi que sur les glandes à soie. La soie chimérique ver à soie / araignée a été analysée et évaluée à environ de 2 à 5% de soie d’araignée. Les protéines de soie hybrides étaient d’environ 100 à 130 k Da. Malgré les faibles taux de protéines de soie d’araignée incorporés dans les fibres chimériques, ces dernières étaient significativement plus solides que les fibres de vers à soie, et aussi solides que la soie dragline naturelle, même si elles n’étaient pas aussi fortes.
Comme le système des bactéries recombinées E. coli, les vers à soie transgéniques peuvent être maintenus dans des conditions strictement contenues et confinées, et c’est très prometteur pour la culture/élevage en vue de produire de la soie d’araignée ou de la soie hybride araignée/vers à soie, avec les propriétés requises.
Il est important de noter que le vecteur d’insecte utilisé piggyBac est un transposon qui a tendance à se remobiliser et à se propager par transfert horizontal de gènes (voir [6, 7] ] Regulation of Transgenic Insects Highly Inadequate & Unsafe, et Transgenic Mosquitoes Not a Solution, SiS 54) *.
*Version en français "Les moustiques transgéniques ne sont vraiment pas une bonne solution" par le Dr Mae-Wan Ho. Traduction et compléments de Jacques Hallard ; accessible sur le site http://isias.transition89.lautre.ne...
C’est pourquoi les vers à soie transgéniques, créés en utilisant les méthodes et techniques du génie génétique, doivent être élevés dans des conditions strictement confinées.

  Pour conclure

La ‘soie d’araignée’ obtenue à partir de protéines recombinantes peut être produite en toute sécurité et efficacement dans des conditions strictement confinées, soit par des bactéries recombinées E. coli, soit par des vers à soie génétiquement modifiés ou transgéniques. Il n’y a donc aucune raison de continuer à envisager la production de cette ‘soie d’araignée’ à partir de chèvres transgéniques, un système qui est resté non caractérisé, et qui n’est ni éthique ni acceptable en termes de sécurité [2].

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 Définitions et compléments

De la soie d’araignée produite par les méthodes et techniques du génie génétique

 Traduction, définitions et compléments :

Jacques Hallard, Ing. CNAM, consultant indépendant.
Relecture et corrections : Christiane Hallard-Lauffenburger, professeur des écoles..
Adresse : 585 19 Chemin du Malpas 13940 Mollégès France
Courriel : jacques.hallard921@orange.fr
Fichier : ISIS Biologie Araignées OGM Genetic Engineering Spider Silk French version.3 allégée.


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