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"Les effets hors-cible de l’édition génomique peuvent-ils être réduits et insignifiants ?" par GM WATCH

Traduction et compléments de Jacques Hallard
jeudi 5 mai 2016 par GMWatch

ISIAS
GMWATCH Génétique Édition du génome

Les effets hors-cible de l’édition génomique peuvent-ils être réduits et insignifiants ?

Des scientifiques commentent une nouvelle étude qui revendique la précision d’une technique de modifications génétiques dénommée ‘CRISPR-Cas9’.

Publié par GMWATCH le 19 mars 2016 sous le titre Can the off-target effects of gene editing be reduced to almost nothing  ; orignal accessible sur le site suivant : http://gmwatch.org/news/latest-news/16814-can-the-off-target-effects-of-gene-editing-be-reduced-to-almost-nothing

Avec ajouts par ISIAS de compléments sur l’édition génomique, sur la technique ‘CRISPR-Cas9’ et des articles d’actualités sur le sujet

Un article paru dans ‘Science Daily’ rapporte une étude publiée dans la revue ‘Nature’ qui a conclu que les effets hors-cible de l’édition génomique *, avec l’aide de la technique ‘CRISPR-Cas9’ **, peuvent être réduits à presque rien.

[#Eins*Voir la définition de l’édition génomique à l’annexe 1[].->#Eins]

[#Zwei**Voir des articles en français et en anglais sur ‘CRISPR-Cas9’ à l’annexe 2[].->#Zwei]


Est-ce le « Saint Graal » des modifications génétiques (OGM) avec l’emploi de cette technique de génie génétique qui est annoncée comme vraiment précise et prévisible ? Nous avons demandé à quelques s scientifiques d’exprimer pour leurs points de vue sur ce sujet.

Le résumé de leurs réactions est donné à la suite :

« Il ne faut pas se laisser prendre par les récits et les définitions de certains ingénieurs génétiques. Dans leur environnement étroit, contrôlé et constant, ils affirment qu’ils ont eu des cas dans lesquels ils pourraient réduire les effets hors-cible à des niveaux non détectables. Cela signifie qu’ils ne les voient pas ; cela ne signifie pas que les effets hors-cible n’existent pas ».

« L’une des raisons pour laquelle les chercheurs n’ont pas détecté des effets hors-cible, peut résider tout simplement dans le fait qu’ils n’ont pas regardé au bon endroit ou qu’ils ne disposent pas de la capacité qui est nécessaire pour détecter de tels effets, même s’ils se trouvent face à eux. Prouver « qu’aucun effet n’existe » est une opération difficile. La preuve doit être établie pour toutes les applications et pour tous les caractères génétiquement modifiés (OGM), dans toutes les conditions et dans tous les environnements. Rien de tout cela ne peut être réalisé au moyen de quelques expériences conduites en laboratoire ».

« L’augmentation de la précision ne signifie un accroissement de la compréhension ou des connaissances. Nous pouvons, d’une manière précise et contrôlée, couper et coller un livre écrit en chinois et pourtant ne pas avoir la moindre idée de ce que nous avons réarrangé. Le récit de précision = contrôle = sécurité, est une erreur ».

« Les protocoles des chercheurs pour la recherche d’effets hors-cible doivent être examinés de manière critique afin de voir où se trouvent leurs limites de détection. Ce qu’ils considèrent comme « non détectable » peut ne pas être « détectable » pour d’autres en dehors de leur monde de laboratoire bien contrôlé ».

« Ces chercheurs et d’autres ingénieurs génétiques continuent à construire sur la base du dogme central de la biologie qui prévaut encore : ’L’information génétique codée en dur dans l’ADN est transcrit en cassettes transportables individuelles, composées de l’ARN messager (ARNm) ; chaque cassette d’ARNm contient le programme pour la synthèse d’une protéine particulière (ou un petit nombre de protéines)’. Ces personnes semblent croire à l’idée réductionniste selon laquelle les organismes vivants sont câblés par leurs gènes. Cependant, nous voyons, au mieux, des preuves limitées (c’est-à-dire partielles et exceptionnelles), qui viennent à l’appui de cela dans la génétique écologique ».

« La capacité de ces techniques d’édition génomique par excision d’ADN est limitée à des traits ou caractères simples, que nous présumons qu’ils sont codés dans certains tronçons courts d’ADN. En réalité, les gènes fonctionnent dans des réseaux adaptatifs complexes qui aident au fonctionnement des organismes vivants et permettent à ceux-ci de s’y adapter, à se modifier rapidement dans les conditions environnementales à l’extérieur des cellules dans les laboratoires des entreprises. Si ces techniques étaient si simples pour modifier quelques courts tronçons de molécules d’acide nucléique, afin de s’adapter et de faire face à des conditions complexes, nous aurions depuis longtemps été en mesure de disséminer des organismes fabriqués à partir de bandes transporteuses d’information génétique. Cela n’est pas le cas de toute évidence, et ne se produira probablement pas dans un avenir prévisible, si jamais - du moins pas avec les techniques qui font appel au système ‘CRISPR-Cas9’ ou avec d’autres techniques qui sont actuellement disponibles. Mais il y a une forte probabilité pour que nous puissions causer de graves problèmes si nous ne parvenions pas à rechercher et détecter assez rigoureusement les lacunes ».

« Actuellement, les probabilités que des effets négatifs pourraient échapper à notre attention et causer de graves problèmes, sont plus grandes que notre capacité à produire quelque chose d’utile. Cela est tout simplement à cause de notre compréhension très limitée de la façon dont la génétique fonctionne vraiment. Nous savons surtout comment elle ne fonctionne pas, c’est-à-dire :

- D’une manière prévisible (déterministe)
- D’une manière non variable
- D’une manière réductionniste.
Malheureusement, ce sont là les conditions fondamentales pré-requises pour que fonctionne le génie génétique, y compris l’édition génomique ».

[Une sélection d’accès à des articles sur les modifications génétiques et l’édition génomique figure à l’annexe 3[].->#Drei]


Annexe 1 - Édition génomique – Reproduction d’un article Wikipédia

L’édition génomique (Genome Editing pour les anglophones) ou « édition du génome avec des nucléases modifiées » aussi désigné par l’acronyme GEEN, pour « genome editing with engineered nucleases ») ou encore parfois dite édition génétique (mais cette expression est à éviter car ayant d’autres sens1) regroupe un ensemble de techniques de manipulations du génome via la « réécriture du matériel génétique » 2, qui peut être appliqué aux plantes, animaux3, champignons et microbes, et que certains laboratoires proposent d’aussi appliquer au génome humain.

Ces techniques sont plus précises que les premières techniques de génie génétique (où les modifications étaient en grandes parties faites au hasard dans le génome). Elles sont utilisées par des laboratoires pour produire des organismes génétiquement modifiés sans avoir recours à la transgénèse, pour des modifications plus précises et parfois avec l’espoir de ne pas soulever les mêmes réticences et controverses que les premières générations d’OGM, ou pour profiter de la législation de certains pays qui contient un vide juridique pour ce type d’organisme en quelque sorte modifiés à partir d’eux-même par simple réécriture du code génétique.
Elles pourraient aussi être appliquées à l’être humain dans l’objectif de réparer des génomes porteurs de mutations délétères4 ou pour certains avec une volonté d’améliorer le génome humain, par exemple dans le contexte du transhumanisme ou du post-humanisme.

Cette technique encore émergente peut potentiellement « révolutionner la médecine personnalisée et la thérapie génique », ce pourquoi elle avait été mise en valeur par Nature Methods comme « méthode de l’année » en 20115, mais elles ont aussi rapidement suscité un appât du gain et des mouvements de privatisation aux États-Unis notamment, avec de nombreuses sociétés et start-ups qui ayant « saisi le potentiel de la technologie CRISPR » ont déclenché une « guerre des brevets »6. Face à cette évolution, plusieurs groupes de scientifiques ont en 2015 publiquement attiré l’attention sur des dérives possible ou en cours concernant des utilisations non-éthiques de ces techniques7,8. De plus, des interrogations persistent quant aux impacts de la spécificité relative de chaque nucléase ou d’effets inattendus ou indésirables de l’utilisation de vecteurs pour le transfert de ces enzymes à l’intérieur des cellules et des organismes9. Ainsi, si l’ADN d’un génome est traité avec une endonucléase de restriction particulière, de nombreuses cassures double brin (CDB) pourront être créés en différents points du génome, ce qui peut être dangereux pour la cellule (effet mutagène). La plupart des enzymes de restriction reconnaissent et ciblent en effet plusieurs paires de base sur l’ADN, et il est très probable que la combinaison de paires de bases particulière se trouve en de nombreux endroits du génome. C’est pour surmonter ce défi et pouvoir cibler plus spécifiquement certains sites que de nouvelles classes distinctes de nucléases ont été créées (par génie génétique) à ce jour (voir plus bas).

Sommaire

Le processus d’édition a d’abord été observé sur les ARN, en 1986 chez des organismes unicellulaires flagellés, les trypanosomes10. Selon C.Marchand (2009) 11 « on définit par édition des ARN, l’ensemble des processus qui produisent des transcrits dont la séquence et l’information sont différentes de celles portées par le gène correspondant. Ces altérations peuvent être des insertions/délétions de bases ou des modifications de bases par désamination. Elles peuvent conduire à des changements d’acides aminés, la création de codons d’initiation ou de terminaison de la traduction, la création de nouveaux cadres de lecture. L’édition peut aussi influer sur la maturation ou l’épissage des ARN. Cette découverte du processus d’édition des ARN a été fondamentale, dans la mesure où elle a remis en question le dogme selon lequel l’information contenue dans le génome est transmise de manière linéaire jusqu’aux protéines ».

Le même processus a été découvert plus récemment dans les ADN, y compris chez l’homme où une famille d’enzymes dits APOBEC3, peut modifier l’ADN (par désamination, observée tant sur les ARN que sur les ADN).

Ces enzymes sont donc mutagènes et en tant que tels sont un danger potentiel pour la cellule, mais le processus - tant qu’il est contrôlé par l’organisme - semble être l’un des mécanismes de défense cellulaire : selon Harris et al. (2002)12 et Petersen-Mahrt & Neuberger, 200313, il permet d’éviter l’invasion du génome humain par des gènes exogènes. L’enzyme n’agit pas seul mais avec l’aide d’une ou plusieurs protéines qui l’aident à cibler le point de l’ADN où il agira (« l’ensemble formant un complexe appelé éditosome »11.

Principes de base de l’édition en tant que technique de génie génétique

Les techniques d’édition de génome regroupent des techniques de génie génétique dans lesquelles un ou plusieurs morceaux d’ADN sont insérés, remplacés ou retirés d’un génome en utilisant nucléases artificiellement modifiées (dites « ciseaux moléculaires »). Le mot anglais « editing » évoque le vocabulaire de l’informatique où la fonction « couper-coller » peut métaphoriquement aussi évoquer les « ciseaux moléculaires » maintenant couramment utilisés par l’ingénierie biomoléculaire (en).

Ces ciseaux sont des nucléases ; des enzymes de restriction qui peuvent sectionner le double-brin d’ADN à des emplacements précis, coupures auxquelles les cellules répondent par des mécanismes de réparation de l’ADN. Ici, l’ingénieur biomoléculaire cherche à bénéficier de deux mécanismes « naturels » de recombinaison que l’on sait maintenant de mieux en mieux contrôler : un mécanisme d’autoréparation du double brind’ADN ; et une potentialité endogène à la cellule (mécanisme très mobilisé par les microbes qui évoluent rapidement et/ou sont capables d’échanger horizontalement des gènes, tels que les bactéries), qui est une capacité à recoller des morceaux d’ADN dans un ordre nouveau.

Pour le génie génétique, ces deux mécanismes sont dénommés ;

  • la recombinaison homologue (RH) ; c’est un type de recombinaison génétique où les séquences de nucléotides sont échangées entre des molécules d’ADN identiques ou similaire. Ce mécanisme est aussi à l’œuvre lors du processus de méiose, par lequel les eucaryotes créent des gamètes et de nouvelles combinaisons génétiques ;
  • la jonction d’extrémités non homologues ; c’est un mécanisme « non-conservatif » (contrairement à la réparation par recombinaison) c’est-à-dire qu’il ne restaure pas la séquence initiale de l’ADN ; mais seulement la continuité de l’ADN endommagé par une cassure double brin. Cette « réparation » permet ainsi de changer l’information génétique, en général via une délétion ou l’apposition d’un gène qui en active ou en inactive un autre ou plusieurs autres, et donc possiblement à l’apparition d’une mutation pour le gène concerné (si la cassure survient à l’intérieur d’un gène).
    Les outils de base de l’édition génomique : les ciseaux biomoléculaires

Quatre familles de nucléases modifiées ont été développées en laboratoire et sont de plus en plus utilisées en génie génétique14,3,15 :

Chez certains organismes, il reste difficile voire impossible d’effectuer une mutagenèse spécifique d’un site ; on utilise alors des méthodes « indirectes » telles que des moyens de rendre silencieux un gène d’intérêt, par interférence par ARN (siRNA)21, mais la perturbation et mise en silence du gène par siRNA peut être instable ou incomplète.

L’édition génomique utilisant des nucléases telles que la ZFN diffère de l’ARNsi en ce que la nucléase utilisée est normalement capable de définitivement modifier l’ADN et peut donc, en principe, inactiver n’importe quelle cible dans le génome, et/ou théoriquement introduire une modification des séquences endogènes pour des gènes qui sont impossibles à cibler spécifiquement par l’ARNi classique.

Les méganucléases

Ces enzymes cytotoxiques sont naturellement et couramment produites par certaines espèces microbiennes ; elles permettent par exemple à des bactéries de détruire des cellules qu’elles infectent ou qui les attaquent. Elles présentent une particularité unique qui les a rendu intéressantes pour les biotechnologues, qui est qu’elles ciblent dans le génome des séquences de reconnaissance très longues (> 14 pb) ce qui les rend ainsi naturellement très « spécifique »22,23. Hélas, au début des années 2000, seules un petit nombre de méganucléases naturelles était connu, loin de pouvoir couvrir toutes les séquences cibles possibles utile à la médecine ou recherchées par l’industrie des biotechnologies23.

Des techniques de mutagenèse et des méthodes d’analyse à haut débit ont alors été utilisées pour créer diverses variantes de méganucléases capables de reconnaissent des séquences d’intérêt médical, scientifique ou commercial23.

Une autre piste, qui a donné certains résultats a consisté à fusionner divers méganucléases existantes pour créer des « enzymes hybrides » ciblant une nouvelle séquence24. Des biotechnologistes ont aussi tenté de modifier des méganucléases existantes pour qu’elles reconnaissent des séquences génétiques spécifiques, via un procédé dit « méganucléase rationnellement conçu » (brevet US 8,021,867 B2).

L’introduction contrôlée d’une méganucléase dans une cellule serait moins toxiques pour la cellule que l’utilisation de procédés de type ZFN, probablement en raison d’une meilleure reconnaissance de la séquence d’ADN recherchée23 ; mais, la construction artificielle de telles enzymes spécifiques est longue et coûteuse et ne bénéficie pas des possibilités combinatoires qui sont celles des méthodes concurrentes telles que ZFN et TALENs.

Les avantages et inconvénients respectifs des diverses méthodes ne sont pas encore clairs et pourraient encore évoluer au gré des avancées scientifiques et techniques.

Les outils ZFN et TALENs

Ils sont basés sur un autre concept opérationnel : ces enzymes coupeurs d’ADN sont non spécifique, mais le deviennent plus si on peut les lier à des peptides capables de reconnaître de séquences d’intérêt dans l’ADN (ex : « doigts de zinc » ou effecteurs dits « transcription activator-like ») 25.

Pour cela il fallait trouver une endonucléase dont la partie consacrée à la « reconnaissance de l’ADN » était différente de la partie responsable du clivage de l’ADN, une situation rare parmi des enzymes de restriction connus25 et pouvoir séparer les deux parties de cet enzyme pour conserver la paire de ciseaux et l’accrocher à une autre molécule jouant le rôle de tête chercheuse. Un tel enzyme a été trouvé à la fin des années 1980 : un enzyme de restriction trouvé chez une flavobactérie]] (Flavobacterium okeanokoites26, et pour cette raison dénommé « FokI »27). Cet enzyme a en outre l’avantage de nécessiter une dimérisation pour avoir une activité nucléase28, ce qui a permis d’augmenter spectaculairement sa spécificité et de le convertir en enzyme de restriction presque universel29,30,31.

Risques et controverses

Comme d’autres méthodes de manipulation du génome, cette technique (en particulier si l’édition génomique devait être appliquée à l’homme sans cadres éthique et réglementaire spécifiques) fait l’objet de controverses.

Ainsi deux groupes de scientifiques ont respectivement publié en 2015 dans les la revue Science7 et dans la revue Nature8 un appel à moratoire dans le domaine de l’édition génomique appliquée au génome humain (y compris par des manipulations portant sur les gènes présents dans le sperme, les ovules et les embryons humains, car si les ciseaux à ADN permettent théoriquement de combattre certaines maladies par la thérapie génique20, ils permettent aussi (par n’importe quelle personne ayant une simple « formation de base à la biologie moléculaire ») d’introduire des informations génétiques nouvelles, et éventuellement délétères.

Ces scientifiques estiment que le bond technologique récent qui nous permet de facilement modifier notre patrimoine génétique et celui d’autres êtres vivants (éventuellement disparus) doit faire l’objet de réflexions éthiques approfondies (ils s’inquiètent par exemple de rumeurs qui laissent penser que des chercheurs chinois ont expérimenté des modifications de génomes sur des bébés humains et de voire des exemples comme la proposition faite en 2012 par George Church promoteur de la biologie synthétique de reconstituer intégralement le génome de l’homme de Néandertal à partir de celui de l’Homo Sapiens32. Ces chercheurs craignent que la « mauvaise publicité » faite par de telles expériences puisse engendrer dans le public et chez les décideurs des réactions d’hostilité à ces techniques, y compris pour des usages légitimes (thérapie génique).

Dans les commentaires respectivement publiés en ligne dans Science le 19 mars 2015 et dans Nature le 12 mars 2015, ces deux groupes de chercheurs font des propositions de mesures à prendre par la communauté scientifique pour constituer un cadre éthique et sécurisé à ces biotechnologies émergentes.

Voir aussi

Sur les autres projets Wikimedia :

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  • McMahon, M.A., Rahdar, M., & Porteus, M., Gene editing : not just for translation anymore. Nat Meth 9 (1), 28-31 (2012).
  • Maria, J., Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases’ Trends in Genetics 12 (6), 224-228 (1996).
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    Notes et références
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  • Blanc, V., Farré, J. C., Litvak, S., & Araya, A. (2002). Réécriture du matériel génétique : fonctions et mécanismes de l’édition de l’ARN. médecine/sciences, 18(2), 181-192
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  • Harris, R. S., Petersen-Mahrt, S. K. & Neuberger, M. S. (2002). RNA editing enzyme APOBEC1 and some of its homologs can act as DNA mutators. Mol Cell 10, 1247-1253.
  • Petersen-Mahrt, S. K. & Neuberger, M. S. (2003). In vitro deamination of cytosine to uracil in single-stranded DNA by apolipoprotein B editing complex catalytic subunit 1 (APOBEC1). J Biol Chem 278, 19583-19586.
  • Esvelt, KM. ; Wang, HH. (2013). ’Genome-scale engineering for systems and synthetic biology [archive].’. Mol Syst Biol 9 (1) : 641. doi:10.1038/msb.2012.66. PMC 3564264. PMID 23340847 [archive]
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  • Revolutionizing genome engineering : Review on history and future of the CRISPR-Cas9 system published [archive]’, Phys.org - 01/12/2014.
  • Jeremy Cherfas (2014) ’CRISPR offers unrestricted opportunities to edit genes [archive]’,, ScienceWatch - 10/2014.
  • a et b BE Etats-Unis 386 - 12/12/2014 / Sciences de la vie / Les nucléases, de fabuleux outils pour la chirurgie du génome : les Etats-Unis se mobilisent [archive]
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  • Mandecki, W., & Boiling, T. J. (1988). FokI method of gene synthesis. Gene, 68(1), 101-107 (résumé [archive]).
  • Li, T., Huang, S., Jiang, W. Z., Wright, D., Spalding, M. H., Weeks, D. P., & Yang, B. (2011). TAL nucleases (TALNs) : hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain. Nucleic acids research, 39(1), 359-372.
  • Church G & Regis E (2012) Regenesis, how synthetic biology will reinvent nature and ourselves, Basis Books, New York,

Retour à l’article original de GMWATCH


Annexe 2 – Articles choisis sur CRISPR/Cas9

Cas9 – Introduction d’un article Wikipédia

Photo d’une structure du Cas9 de S. pyogenes dans un complexe avec un ARNm subgénomique et son ADN cible1. [A visionner à la source].

Cas9 (CRISPR associated protein 9) est une endonucléase, c’est-à-dire une enzyme spécialisée pour couper l’ADN avec deux zones de coupe actives, une pour chaque brin de la double hélice. Cette enzyme peut être utilisée pour modifier facilement et rapidement le génome des cellules animales et végétales. Ce genre d’outil existait depuis les années 70 mais ces outils étaient bien moins efficaces et bien plus coûteux que Cas9.

Article complet sur https://fr.wikipedia.org/wiki/Cas9

Crispr/Cas9 : des nouveaux ciseaux à ADN

Auteur : Eric MEUNIER, 7 novembre 2014 - Lien permanent | Version imprimable de cet articleVersion imprimable | tétécharger en pdf | Tip A Friend Envoyer par email– [EXTRAIT par ISIAS d’un document ‘Inf’OGM’ - Actualités > n°131, novembre / décembre 2014 |

Certaines techniques de biotechnologie utilisent des protéines capables de couper l’ADN comme des ciseaux : nucléases à doigt de zinc, méganucléases ou encore TALENs [1]. Cette famille de protéines vient d’accueillir un nouvel arrivant, au nom barbare de Crispr/Cas9. L’objectif est le même : couper le génome à un endroit pour y induire une mutation ou y insérer un gène. La différence entre ces techniques se situe au niveau de l’outil utilisé : une protéine, plusieurs protéines, une protéine en complexe avec un ARN... Chacun de ces outils a un niveau différent de précision pour couper le génome et une « facilité » d’utilisation différente.

Le nom Crispr/Cas9 s’applique aussi bien à la technique qu’à la construction génétique introduite dans les cellules végétales. Dans le détail, cette construction génétique se compose de trois éléments : Cas9, Crispr et Tracr (cf. schéma).

La séquence Tracr code un ARN qui s’hybridera avec l’ARN guide dont nous allons parler. La séquence Cas9 code la protéine de même nom, protéine qui appartient à la famille des nucléases dont l’activité est de couper le génome comme un ciseau. Les séquences génétiques Crispr sont des groupes de séquences répétées à intervalles réguliers (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, Crispr). Ces séquences sont présentes dans le génome de bactéries et de microorganismes unicellulaires très anciens appelés archées. Leur rôle n’est cependant pas encore complètement compris. Il pourrait être de participer à la réparation du génome mais aussi être un mécanisme de défense des bactéries et archées (ou archéobactéries) contre des phages (virus infectant les bactéries) [2]. Comme le montre le schéma, il est en tout cas montré que le complexe Crispr/Cas9 est utilisable pour modifier le génome… ».

Article complet avec schémas explicatifs d’Inf’OGM à lire sur http://www.infogm.org/5744-crispr-cas9-des-nouveaux-ciseaux-a-adn

Des technologies de ciblage et de modification des séquences génétiques précises et efficaces – Communiqué de l’entreprise ‘ThermoFsher Scientific’

Des technologies de modification génomique de précision et de modification génétique aux systèmes de libération haute efficacité, nous avons développé une vaste gamme de solutions pour vous aider à créer les gènes modifiés, les systèmes d’expression et les lignées cellulaires stables dont vous avez besoin pour votre recherche, de la mise en culture de cellules à la modification, à la détection et à l’analyse. Nos technologies, notamment les produits GeneArt® TAL et CRISPR, vous permettent de modifier des séquences génomiques et d’analyser les résultats phénotypiques de manière fiable. En outre, nous pouvons mettre en place une combinaison de technologies avancées afin de produire une construction ou une lignée cellulaire personnalisée qui réponde à vos spécifications. Harmonisant les performances et les coûts, notre gamme pour engineering cellulaire est fondée sur 20 ans d’innovations à la pointe de l’industrie et elle peut évoluer selon vos besoins de recherche.

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Source : https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/genome-editing.html

Historique CRISPR/Cas9 – Extrait du site de ‘Santa Cruz Biotechnology’

Le système CRISPR/Cas est un mécanisme de défense immunitaire adaptatif utilisé par les bactéries et les lignées Archea pour la dégradation du matériel génétique qui leur est étranger. Dans ces organismes, le matériel génétique étranger provenant d’un bactériophage est acquis et intégré dans le locus CRISPR (1,2). Ce nouveau matériau, aussi connu comme un élément d’espacement, crée un fragment spécifique de la séquence utilisée pour la résistance contre une future infection bactériophage. Ces fragments spécifiques d’une séquence sont convertis en ARNs courts CRISPR (crARNs) et fonctionnent comme guide pour diriger le clivage de l’ADN complémentaire invasif par l’activité nucléase de la protéine associée-CRISPR (Cas) également codée par le locus CRISPR (1,2). La protéine nucléase Cas9 du système de CRISPR de type II possède un domaine de liaison à l’ARN, un lobe de reconnaissance d’hélice alpha (REC), un lobe de nucléase qui comprend le RuvC et HNH pour le clivage de l’ADN, et un site d’interraction du motif adjacent de protospacer (PAM) (1,2). Le crARN forme un complexe avec la nucléase Cas9 en se liant au lobe de REC, et forme plusieurs ponts salins avec le backbone du crARN (1,2,3).

Une fois que le crARN se lie à la Cas9, la conformation de la nucléase Cas9 change et crée un canal permettant la liaison de l’ADN (1,2,3). Le complexe Cas9/crARN analyse l’ADN pour trouver un site PAM (5’-NGG) (4,5,6). La reconnaissance d’un site PAM conduit au déroulement de l’ADN, et permet au crARN de vérifier la complémentarité de l’ADN adjacent au site PAM. Lorsque Cas9 se lie à un site PAM adjacent à une séquence d’ADN complémentaire du crARN, le lobe REC crée un hétéroduplex ARN-ADN avec l’ADN cible (3,4,7). La reconnaissance du site PAM est impliquée dans l’activation des domaines HNH et RuvC nucléolytiques qui entraine une coupure du double brin (DSB) dans l’ADN cible, conduisant à la dégradation de l’ADN (1,2,5,8). Si le crARN n’est pas complémentaire, alors Cas9 libère et recherche un autre site PAM (7). Les ruptures ciblées des brins du génome dans l’ADN peuvent être réparées via la voie de réparation des extrémités de jonction non homologues (NHEJ), qui entraine des insertions ou des suppressions créant des erreurs, ou par la voie de réparation homologue dirigée (HDR), qui peut être utilisée pour recombiner les marqueurs sélectionnés à des sites spécifiques dans le génome (2,9,10). Ce mécanisme CRISPR/Cas9 peut être réutilisé pour l’ingénierie génomique de divers systèmes, y compris les cellules mammaliennes.

La modification du génome via l’introduction de DSBs peut être réalisée avec des méganucléases, des nucléases à doigts de zinc (ZF), ou des effecteurs transactivateurs (TALEs), qui reconnaissent des séquences d’ADN, cependant, chacune de ces techniques a ses limites. Lors de l’utilisation de méganucléases il est difficile de montrer clairement la reconnaissance spécifique de site entre la nucléase et l’ADN (2). Les autres options, ZFs et TALEs, se sont avérées difficiles à concevoir et à reconnaître plus de 3 nt de l’ADN (2). Les ARN guides simples (sgARNs) qui agissent comme les crARNs sont facilement conçus et peuvent être exprimés avec la nucléase Cas9 dans le même vecteur pour cibler des sites spécifiques de l’ADN pour la modification du génome. Le système CRISPR/Cas9 dispose également d’une plus grande sensibilité et est plus efficace lorsqu’il est utilisé pour le screening que les petits shARN (small hairpin ARNs).

L’avantage principal de l’utilisation du système CRISPR/cas9 pour induire le DSB dans l’ADN génomique est son haut niveau d’efficacité. Cependant, cette efficacité peut être obscurcie par un certain nombre d’effets hors-cible, réduisant ainsi la spécificité de ce CRISPR/cas9. La spécificité peut être améliorée en utilisant un système CRISPR double nickase, dans lequel une paire de plasmides, chacun codant pour un cas9 (D10A) mutant nickase (Cas9n), sont dirigés vers un site spécifique d’une région distinct de l’ADN génomique grâce à un ARN guide spécifique de la cible (12). Chaque complexe Cas9n/sgARN crée une seule entaille dans le brin d’ADN qui est complémentaire de l’ARN guide (% link_12%). Chaque paire d’ARN guide est décalée d’environ 20 pb et reconnaît les séquences cibles situées sur les brins opposés de l’ADN cible. La double entaille créée par la paire de complexes Cas9n/ARNsg imite un DSB (% link_12%). Ainsi, l’utilisation de paires d’ARN guide permet d’accroitre la spécificité de l’édition du gène-cible, tout en maintenant un haut niveau d’efficacité (% link_12%).

En plus de la modification du génome, le système de CRISPR a été conçu pour permettre l’activation significative de l’expression du gène endogène (13). Plusieurs composants du système de CRISPR ont été modifiés pour générer le complexe médiateur d’activation synergique (SAM) qui aboutit à un système d’activation de la transcription hautement efficace et spécifique (13). L’un des composants du complexe SAM modifié est la nucléase Cas9. Dans le système SAM, les domaines catalytiques de Cas9 sont désactivés et le dCas9 résultant est fusionné à un domaine d’activation de transcription (VP64). Dirigé par un ARN guide (sgRNA) cible, le complexe dCas9-VP64-sgRNA cible la région de 200pb du Site Transcriptionel de Départ (TSS) des gènes cellulaires pour réguler positivement l’expression de ces gènes (13). Pour améliorer la transcription, le sgARN a été modifié en y ajoutant un aptamère hairpin (épingle à cheveux) à la tétraboucle et à la tige de la boucle 2 (13). Ce aptamère sur le sgARN se lie sélectivement aux protéines d’enveloppe du bactériophage MS2 dimérisés (13). Fusioner les protéines MS2 aux domaines de transactivation p65 et HSF1 permet à la protéine de fusion résultante MS2-P65-HSF1 d’améliorer le recrutement de facteurs de transcription, améliorant ainsi la puissance de l’activation de gènes médié par dCas9 (13).

Lire l’article complet avec illustrations et références sur le site : http://www.scbt.com/fr/fr/crispr-cas9_system.html

The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond – Auteurs : Luisa Bortesia, , , Rainer Fischera, b - Show more doi:10.1016/j.biotechadv.2014.12.006 - Get rights and content - Under a Creative Commons license - Open Access

Abstract

Targeted genome editing using artificial nucleases has the potential to accelerate basic research as well as plant breeding by providing the means to modify genomes rapidly in a precise and predictable manner. Here we describe the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system, a recently developed tool for the introduction of site-specific double-stranded DNA breaks. We highlight the strengths and weaknesses of this technology compared with two well-established genome editing platforms : zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs). We summarize recent results obtained in plants using CRISPR/Cas9 technology, discuss possible applications in plant breeding and consider potential future developments.

Keywords : CRISPR ; Cas9 ; Site-specific nuclease ; Genome editing ; Targeted mutagenesis ; Gene targeting ; Plants

Introduction

Genome editing with site-specific nucleases allows reverse genetics, genome engineering and targeted transgene integration experiments to be carried out in an efficient and precise manner. It involves the introduction of targeted DNA double-strand breaks (DSBs) using an engineered nuclease, stimulating cellular DNA repair mechanisms. Different genome modifications can be achieved depending on the repair pathway and the availability of a repair template (Fig. 1). Two different DSB repair pathways have been defined : non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). In most cases, NHEJ causes random insertions or deletions (indels), which can result in frameshift mutations if they occur in the coding region of a gene, effectively creating a gene knockout. Alternatively, when the DSB generates overhangs, NHEJ can mediate the targeted introduction of a double-stranded DNA template with compatible overhangs (Cristea et al., 2013 and Maresca et al., 2013). When a template with regions of homology to the sequence surrounding the DSB is available, the DNA damage can be repaired by HR, and this mechanism can be exploited to achieve precise gene modifications or gene insertions. Even though the generation of breaks in both DNA strands induces recombination at specific genomic loci, NHEJ is by far the most common DSB repair mechanism in most organisms, including higher plants, and the frequency of targeted integration by HR remains much lower than random integration (Puchta, 2005). Strategies such as the overexpression of proteins involved in HR or the use of negative selection markers outside the homology regions of the insertion cassette to prevent the survival of random integration events can achieve moderate improvements in gene targeting efficiency (reviewed in Puchta and Fauser, 2013).

Lire l’article complet avec illustrations et applications sur le site : http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975014001931

Crispr-Cas9 : Revolutionary gene editing technique named scientific breakthrough of the year - It is the first time that a top breakthrough had also been a runner-up twice before - Steve Connor Science Editor @SteveAConnor - Thursday 17 December 2015

Photo à visionner à la source : Researchers Jennifer Doudna, left, and Emmanuelle Charpentier, who described Crispr’s capabilities as ‘mind-blowing’ Steve Jennings / Getty

A revolutionary technique for editing the DNA of the human genome with extreme precision, which has already been used to alter the genes of “spare” human IVF embryos in a controversial experiment conducted in China, has been named as the scientific breakthrough of the year.

The gene-editing technology called Crispr-Cas9 was voted by the editors of the American journal Science as the most important research breakthrough of 2015. Its selection was unprecedented given that it is the first time that a top scientific breakthrough had also been a runner-up twice before.

“But this is the year it broke away from the pack, revealing its true power in a series of spectacular achievements,” said John Travis, managing news editor of Science. Read more

Crispr : The science behind a ’game-changing’ gene-editing technique

The British journal Nature also cited Crispr-Cas9 in its “ten people who mattered” in 2015. The journal said that Jun Jiu Huang of Sun Yat-sen University in Guangzhou deserves recognition for his bold, but highly controversial attempts at editing the DNA of human IVF embryos with Crispr-Cas9.

Dr Huang deliberately chose “spare” IVF embryos that were unable to develop in the womb for an experiment to disable the gene responsible for the blood disorder beta-thalessaemia. He told Nature earlier this year that he did it to warn people off using Crispr-Cas9 on viable IVF embryos until it was proven to be safe.

“We wanted to show our data to the world so people know what really happened with this model. We wanted to avoid ethical debate,” he said.

However, when the details of the research emerged it created deep concern around the world. It triggered an international summit in Washington in December to discuss the ethics of engineering the human “germline” – sperm, eggs and embryos – using Crispr-Cas9.

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“At one point during the human gene-editing summit, Charpentier described its capabilities as ‘mind blowing’. It’s the simple truth. For better or worse, we all now live in Crispr’s world,” Mr Travis said.

In addition to attempt at editing unviable IVF embryos, scientists also used Crispr-Cas9 to develop so-called “gene drive” technology, where the frequency of genetically-modified traits can be amplified within a breeding population of insects so that up to 99 per cent of the subsequent offspring quickly inherit the GM trait.

In 2015, scientists demonstrated a Crispr-Cas9 gene drive in lab-grown fruit flies, showing that 97 per cent of them can end up inheriting a GM gene for body colouration. Other researchers followed this up with laboratory studies demonstrating how gene drives can disseminate malaria resistance genes, or infertility genes in breeding populations of mosquitoes – with the aim of controlling the spread of mosquito-borne infections.

“Debates are now erupting over the benefits and ecological risks of releasing such insects into the wild – and whether gene drives could also thwart invasive species such as Asian carp and cane toads, combat other animal-borne pathogens such as the one causing Lyme disease,” Mr Travis said.

“In short, it’s only slightly hyperbolic to say that if scientists can dream of a genetic manipulation, Crispr can now make it happen,” he said.

Source : http://www.independent.co.uk/news/science/crispr-cas9-revolutionary-gene-editing-technique-named-scientific-breakthrough-of-the-year-a6777426.html

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Annexe 3

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Manipulation génétique - Définition - Santé-Médecine

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Le principe de la manipulation génétique d’un point de vue général est soit d’intégrer des gènes étrangers, végétaux ou animaux, dans le corps d’un membre ...

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25 avr. 2015 - Modification génétique d’un embryon humain en Chine : bienvenue dans ce monde où l’Occident a perdu le monopole de la science de pointe 

Bataille de brevets autour de l’édition du génome L’Express‎ -

Bataille de brevets autour de l’édition du génome - Le Parisien

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La technique d’édition du génome, très prometteuse pour ses applications possibles notamment dans le domaine de la santé, est au coeur ...

ÉDITION du GÉNOME : Un mode d’emploi en 3 dimensions ...

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3 mai 2015 - Le système d’édition du génome » CRISPR/Cas » est aujourd’hui reconnu comme l’une des technologies biomédicales de pointe et d’avenir*.

édition du génome - LabCluster

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Édition du génome. Le développement récent de nouvelles technologies d’édition ciblée du génome a révolutionné les domaines de l’ingénierie du génome ...

’Edition’ du génome : espoirs mais aussi inquiétudes - 01/12 ...

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1 déc. 2015 - (AFP) - Les techniques d’’édition’ du génome, permettant de modifier de façon précise l’ADN, suscitent de vastes espoirs mais aussi ...

La transgénèse 2.0 avec CRISPR : modification génétique ...

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18 déc. 2015 - La transgénèse 2.0 avec CRISPR : modification génétique multiple et édition du génome sans laisser de traces. Publié le vendredi 18 ...

Brève sur l’édition de génomes 2 : quelques faits rapides ...

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4 déc. 2015 - Jusqu’ici, une seule étude de l’édition de génome humain dans des cellules germinales (permettant potentiellement de développer un ...

Bataille de brevets autour de l’édition du génome

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La technique d’édition du génome, très prometteuse pour ses applications possibles notamment dans le domaine de la santé, est a.

Édition du génome : les découvreuses... - Google Actualités

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Bataille de brevets autour de l’édition du génome
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Ce système d’édition du génome, conçu par des scientifiques de l’Université Temple ouvre une toute nouvelle voie de traitement, aux patients ...

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À côté de l’édition du génome, le Prix L’Oréal-UNESCO a choisi de récompensé trois chercheuses ayant travaillé sur des virus.

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CNW Telbec (Communiqué de presse)-

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Edition’ du génome : espoirs mais aussi inquiétudes

ladepeche.fr-30 nov. 2015

(AFP) - Les techniques d’’édition’ du génome, permettant de modifier de façon précise l’ADN, suscitent de vastes espoirs mais aussi ...

Le sommet international sur l’édition du génomehumain s’est ouvert...
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Des mutations génétiques d’une complexité extrême

Les Échos-20 mars 2016

De plus en plus de patients cancéreux ont bénéficié d’un séquençage du génome de leur tumeur. Ces analyses ont révélé l’extrême ...

Le cancer peut-il avoir un « juste » prix ?

Les Échos-20 mars 2016

Cette complexité du génome des cellules tumorales explique l’apparition rapide de résistances des tumeurs aux thérapies anticancéreuses

Édition du génome : les découvreuses de CRISPR/Cas9 mettent en garde contre les dérives

Avancer ’pas à pas’ : découvreuses de la technologie d’édition du génome ’CRISPR/Cas9’, les chercheuses Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna insistent désormais sur les risques de dérives. Emmanuelle Charpentier sera l’invitée du Magazine de la Santé ce 24 mars, jour où elle recevra également, avec sa consœur, le Prix ’L’Oréal-Unesco pour les femmes et la science’.

http://www.francetvinfo.fr/skin/www... rédaction d’Allodocteurs.fr

Mis à jour le 23/03/2016 | 16:41, publié le 23/03/2016 | 14:51

LA NEWSLETTER ACTU Nous la préparons pour vous chaque matin

La microbiologiste française Emmanuelle Charpentier, installée à Berlin, et la biochimiste américaine Jennifer Doudna ont inventé en 2011 une technique permettant d’éliminer et d’ajouter des fractions de matériel génétique avec une extrême précision (un peu comme un logiciel de traitement de texte permet d’éditer ou de corriger la typographie d’un document). Leur découverte, baptisée CRISPR-Cas9, a engagé une véritable révolution dans le monde de la génétique.

Simples d’usage, efficaces et peu coûteux, ces ’ciseaux génétiques’ soulèvent beaucoup d’espoir notamment pour le traitement de certaines maladies. Mais aussi des interrogations. 

’Comme pour toute technologie, il peut y avoir un voyou’ qui cherche à s’en servir, convient Mme Doudna, professeur à l’Université de Californie à Berkeley, dans un échange avec l’AFP.

’Mais il y a également un risque de surexcitation autour de cet outil, qui pourrait conduire des gens, même bien attentionnés, à pratiquer des expériences susceptibles d’avoir des effets inattendus’, avertit-elle. ’J’espère que la communauté scientifique va accepter de procéder suffisamment lentement pour éviter de mauvaises choses.’

L’annonce faite il y a un an que cet outil avait été utilisé par une équipe chinoise sur des cellules d’embryons humains a suscité l’inquiétude de certains experts.

Début février 2016, le Royaume-Uni a lui aussi autorisé le recours à CRISPR-Cas9 sur des embryons humains pour des recherches autour de la prévention des fausses couches.

La crainte de dérives eugénistes

’En tant que scientifique, je pense que c’est probablement une bonne chose […] car c’est à des fins de recherche’, déclare Mme Doudna. ’Mais je ne soutiens absolument pas l’usage clinique qui pourrait être fait de cet outil sur l’embryon humain, par exemple pour créer une personne’.

Fabriquer des bébés sur mesure, en sélectionnant leurs caractères physiques ou intellectuels, ne serait ’certainement pas une bonne chose’. ’Mais je pense que la tentation va croître à mesure que les techniques s’amélioreront’, reconnaît-elle.

’Avant que l’on puisse utiliser un jour CRISPR-Cas9 pour fabriquer des bébés à la carte, il y a encore pas mal de travail à faire’, relève pour sa part Emmanuelle Charpentier, interrogée séparément par l’AFP.

Plus globalement, la française se déclare ’réservée’ concernant la manipulation des embryons et des cellules germinales (reproductrices) humaines. ’J’ai besoin d’en voir plus [pour être] convaincue de l’utilité de ce genre de recherche’, explique-t-elle.

D’une manière générale, elle souligne que l’outil CRISPR-Cas9 est ’très puissant’ mais qu’il doit encore être ’testé’ en laboratoire pour ses diverses applications.

’Mon sentiment est que tout va très vite. Je pense qu’il faut procéder pas à pas’, déclare la biologiste. Les pays doivent, selon elle, adapter et préciser leurs réglementations par rapport à ce nouvel outil.

En octobre 2015, le Comité international de bioéthique de l’Unesco a appelé à un moratoire sur les techniques d’édition de l’ADN des cellules reproductrices humaines afin d’éviter une modification ’contraire à l’éthique’ des caractères héréditaires des individus – alertant contre les tentations eugénistes.

Un sommet international sur l’édition du génome humain qui s’est tenu en décembre 2015 à Washington a conclu que la recherche fondamentale et préclinique devrait se poursuivre activement dans ce domaine vu son potentiel médical mais être supervisée sur le plan légal et éthique.

Si des cellules embryonnaires ou reproductrices humaines avaient leur ADN modifié, ’elles ne pourraient en aucun cas être utilisées pour une grossesse’, comme l’interdisent de nombreux pays, selon l’Académie américaine des sciences, organisatrice de cette réunion.

FRANCETV INFO VOUS RECOMMANDE

CRISPR : la découverte qui met la génétique en ébullition

Auteur : Yann Verdo / Journaliste | Le 15/04 à 07:00, mis à jour à 07:286. Document ‘lesechos.fr’

Les chercheuses Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna sont prises dans un véritable thriller scientifico-juridico-commercial depuis qu’elles ont découvert une technique révolutionnaire de modification de l’ADN. Un confrère revendique la paternité du procédé. La course aux applications thérapeutiques est lancée, alors que les questions éthiques sont encore nombreuses…

Lire l’article complet sur le site : http://www.lesechos.fr/week-end/business-story/enquetes/021837069995-crispr-la-decouverte-qui-met-la-genetique-en-ebullition-1214210.php#

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Traduction, compléments entre […], ajout d’annexes sur l’édition génomique, la technique ‘CRISPR-Cas9’, des accès à des articles d’actualités sur le sujet et intégration de liens hypertextes :

Jacques HALLARD, Ingénieur CNAM, consultant indépendant – 15/04/2016 –

Site ISIAS = Introduire les Sciences et les Intégrer dans des Alternatives Sociétales http://www.isias.lautre.net/

Adresse : 585 Chemin du Malpas 13940 Mollégès France

Courriel : jacques.hallard921@orange.fr

Fichier : ISIAS GMWATCH Génétique Édition du génome Can the off-target effects of gene editing be reduced to almost nothing French version.2

Mis en ligne par Pascal Paquin de Yonne Lautre, un site d’information, associatif et solidaire(Vie du site & Liens), un site inter-associatif, coopératif, gratuit, sans publicité, indépendant de tout parti,

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