"Les mutations hors cible ne sont pas le seul problème posé par les plantes génétiquement modifiées par le forçage génétique (‘gène drive’ ou édition génomique avec CRISPR)" par GMWatch

Traduction et compléments de Jacques Hallard


ISIAS Génétique OGM

Les mutations hors cible ne sont pas le seul problème posé par les plantes génétiquement modifiées par le forçage génétique (‘gène drive’ ou édition génomique avec CRISPR)

L’article d’origine a été publié par GMWatch le 10 juillet 2019 sous le titre « Off-target mutations not the only concern in gene-edited plants  » et il est consultable sur ce site : https://www.gmwatch.org/en/news/latest-news/19039-off-target-mutations-not-the-only-concern-in-gene-edited-plants

Une revue scientifique minimise le potentiel de l’outil d’édition de gènes CRISPR mais ne peut pas nier ses problèmes, y compris ses effets involontaires ou non intentionnels sur le site ciblé. Illustration

Une revue publiée plus tôt cette année aborde la tendance problématique des outils d’édition génomique CRISPR pour provoquer des mutations non ciblées (avec des dommages à l’ADN) et se demande s’il s’agit d’une préoccupation lorsqu’il s’agit de développer des plantes modifiées par génie génétique [1].

Les auteurs de la revue (voir résumé ci-dessous) ont conclu en disant que ’CRISPR / Cas est une technologie révolutionnaire qui permet de modifier le génome des plantes avec une précision sans précédent’. Mais ils reconnaissent également que la technique pose des problèmes persistants et affirment qu’il faut ’beaucoup plus de recherche’ pour déterminer l’étendue de ses effets non intentionnels sur les plantes.

Le message clé de cet examen est que le principal problème de CRISPR est sa tendance à causer des dommages à l’ADN non ciblé. Les auteurs suggèrent que ce problème peut être résolu en ciblant plus précisément le « montage » initial sur l’emplacement souhaité dans l’ADN de l’organisme.

Cependant, il existe un autre problème avec CRISPR qui ne sera jamais résolu par cette approche - à savoir les effets non voulus, non intentionnels des modifications sur la cible. Ces effets non intentionnels résultent du processus de réparation de l’ADN de la cellule après que le CRISPR ait rempli sa fonction de « modification génétique ». Les ingénieurs génétiques n’ont aucun contrôle sur eux !

Les auteurs de la revue, Florian Hahn et Vladimir Nekrasov, sont basés à Rothamsted Research au Royaume-Uni. Cet institut Rothamsted travaille en partenariat avec des sociétés qui fabriquent des OGM, telles que Syngenta et Bayer (Monsanto).

Les contradictions exprimées

La revue est étrangement contradictoire, revendiquant une précision miraculeuse pour CRISPR, tout en reconnaissant un manque de précision et des effets non intentionnels.

Comme le soulignent Hahn et Nekrasov, les outils d’édition de gènes CRISPR ’ne sont pas précis à 100%’ et sont capables de couper de l’ADN sur des sites non cibles partageant des similitudes avec les sites cibles.

Cependant, ils ajoutent que, bien que les outils CRISPR puissent produire de nombreuses mutations non ciblées chez les animaux, la plupart de ces outils sont ’extrêmement précis lorsqu’ils sont appliqués sur des plantes’.

Néanmoins, les auteurs admettent ’qu’un certain nombre de rapports sur des plantes ont clairement démontré que CRISPR / Cas est capable d’introduire des mutations dans des sites non ciblés, qui partagent une similitude significative avec les cibles’.

En outre, ils citent une étude [2] qui a révélé que le processus de culture tissulaire, qui est effectué avec toutes les plantes génétiquement modifiées (y compris les gènes modifiés), est une source majeure de mutations.

Ils recommandent d’utiliser certains outils d’édition génomique dont les performances sont meilleures que d’autres, car ils ciblent plus précisément l’ADN coupé et, sur la base de preuves limitées, réduisent le nombre d’effets non ciblés.

Mais, selon les propres mots des auteurs, ’ces outils ne sont pas censés être plus précis dans les plantes’. En d’autres termes, il n’a pas encore été prouvé qu’elles soient précises sur toute une gamme de plantes travaillées. Et comme le reconnaissent Hahn et Nekrasov, lorsqu’un type d’outil CRISPR ’haute fidélité’ était appliqué aux plantes Arabidopsis, les effets hors cible étaient effectivement réduits, mais son efficacité dans la production du montage souhaité était également réduite. C’est un problème pour les ingénieurs en génie génétique.

Les auteurs discutent de l’utilisation des outils d’édition CRISPR sous la forme d’un type de complexe protéique appelé ribonucléoprotéines (RNP) en tant qu’option pour réduire les effets hors cible chez les plantes.

[D’après Wikipédia, « Ribonucléoprotéine - Pour les articles homonymes, voir RNP. Une ribonucléoprotéine (RNP) est une nucléoprotéine qui contient de l’ARN, c’est-à-dire une association qui combine de l’acide ribonucléique et des protéines ensemble. On en connaît des exemples comme :

Les ribonucléoprotéines RNP ont suscité de chez l’intérêt chez des chercheurs travaillant avec CRISPR car ils peuvent être facilement reprogrammés pour cibler n’importe quel endroit souhaité du génome à éditer. Les auteurs de la revue notent que cela a été appliqué dans plusieurs types de plantes. Malheureusement pour les amateurs d’édition génomique qui préféreraient laisser derrière eux, la controverse entourant les OGM transgéniques à l’ancienne, qui introduisent l’ADN « étranger » inséré par une bactérie appelée Agrobacterium, la méthode RNP ne fonctionne tout simplement pas dans de nombreuses plantes. Hahn et Nekrasov ont déclaré : « De nombreuses espèces de plantes ne peuvent être transformées de manière stable que par la transformation induite par Agrobacterium, ce qui est incompatible avec la stratégie RNP ».

Hahn et Nekrasov suggèrent que la stratégie la plus efficace pour éviter les effets hors cible lors de l’utilisation de CRISPR consiste à sélectionner les bons sites cibles pour la coupe, en fonction de la connaissance de la séquence génomique de l’espèce. Les meilleurs sites à sélectionner sont ceux avec un nombre minimal de cibles non conformes, comme le prédisent les algorithmes informatiques. En outre, pour chaque ’événement’ de transformation d’édition génomique, des ARN guides (sgRNA, la molécule qui guide l’outil d’édition sur le site de l’ADN à couper ou à ’éditer’) doivent être conçus avec le nombre minimal de prédiction hors cibles.

Les effets hors cible ne sont pas le seul problème rencontré

Les auteurs de la revue affirment à juste titre que les effets hors cible ne constituent pas la seule préoccupation autour de l’emploi de CRISPR. Même si les chercheurs finissent par trouver un moyen de cibler avec précision la coupe effectuée sur un site spécifique de l’ADN tout en excluant d’autres sites non ciblés, des modifications non intentionnelles peuvent également se produire sur le site de la coupe d’ADN envisagée.

Citant une étude sur des cellules de souris et d’homme, les auteurs ont écrit : ’Kosicki et al ont récemment rapporté des modifications non ciblées de la cible, telles que des délétions, des insertions et des inversions chromosomiques importantes, dans des cellules souches embryonnaires de souris et chez des cellules humaines différenciée’.

De tels réarrangements chromosomiques ne sont pas toujours faciles à détecter et de nombreuses études publiées sur l’utilisation de CRISPR chez les plantes peuvent donc les avoir manquées, notent les auteurs. Selon les études citées par les auteurs de la revue, d’autres modifications non souhaitées, telles que l’insertion de matériel génétique dans le site de coupe correctement ciblé, ont été rapportées, selon les études citées par les auteurs de la revue [3].

Il n’est donc pas surprenant que Hahn et Nekrasov n’aient pas de solution au problème des effets non intentionnels de CRISPR sur le site ciblé. Ils déclarent seulement : « Il faut beaucoup plus de recherches pour déterminer si des modifications non intentionnelles sur la cible, telles que des insertions, des délétions ou des inversions chromosomiques importantes, induites par CRISPR / Cas sont un phénomène courant chez les plantes. »
La précision de la coupe initiale n’est donc pas pertinente.

Depuis la publication de la revue de Hahn et Nekrasov, un article [4] a été publié sur un site Web avant la publication, remettant en cause leur implication selon laquelle l’amélioration de la précision de la coupe initiale de CRISPR rendra l’édition génomique plus sûre, plus prévisible et plus contrôlable.

Rubina Tuladhar et ses collègues ont étudié les résultats obtenus dans les cellules humaines lorsque le système CRISPR était utilisé pour neutraliser une fonction génétique en perturbant sa séquence normale d’unités de base. Cette perturbation prend la forme d’insertions et / ou de délétions d’étendues relativement petites d’unités de base d’ADN (’indels’).

[Selon Wikipédia, « Indel est un mot-valise utilisé en génétique et en bio-informatique pour désigner une insertion ou une délétion dans une séquence biologique (acide nucléique ou protéine) par rapport à une séquence de référence. On peut observer en particulier mettre en évidence des indels lorsqu’on effectue des comparaisons au moyen de programmes d’alignement de séquences. Le terme indel a été introduit parce que la notion d’insertion ou de délétion est relative suivant le choix de la séquence utilisée comme référence : à une insertion dans une séquence correspond une délétion dans la séquence qui lui est comparée. Indel permet ainsi de désigner globalement la variation biologique, sans préjuger de quelle séquence constitue la référence. Le mot indel a été inventé par le mathématicien Joseph Kruskal1. Les indels sont la conséquence de mutations génétiques donnant lieu à des variations de séquence, soit au sein de la même espèce (c’est un exemple de variation allélique), soit entre espèces, au cours de l’évolution. On estime par exemple que le génome humain contiendrait environ 500 000 sites polymorphiques correspondant à des indels2… » - Article complet sur ce site : https://fr.wikipedia.org/wiki/Indel ].

Les indels sont en fait produits par le processus de réparation de l’ADN connu sous le nom d’assemblage final non homologue (NHEJ). NHEJ est activé dans le noyau cellulaire après que le CRISPR a cassé son ADN double brin, dans le but de réparer les extrémités coupées de la molécule d’ADN.

[D’après Wikipédia, « NHEJ - Jonction d’extrémités non homologues - Pour les articles homonymes, voir CDB. La jonction d’extrémités non homologues (en anglais Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) est un mécanisme de réparation de l’ADN qui permet de réparer des lésions provocant des cassures double brin (CDB). C’est un mécanisme non-conservatif (contrairement par exemple à la réparation par recombinaison) c’est-à-dire qu’il ne restaure pas la séquence initiale de l’ADN ; mais seulement la continuité de l’ADN endommagé par une cassure double brin. Cette réparation conduira ainsi au changement de l’information génétique, en général une délétion, et donc possiblement à l’apparition d’une mutation pour le gène concerné si la cassure survient à l’intérieur d’un gène. Cette réparation est possible grâce à l’intervention de la protéine Ku70/80 (dimère entre deux sous-unités : Ku70 et Ku80) qui va interagir avec les deux extrémités d’ADN résultant de la cassure. Cette protéine va ensuite agir par essais et erreurs pour tenter d’établir une interaction transitoire entre les deux extrémités d’ADN. Pour cela, Ku possède plusieurs activités :

  • activité nucléase : élimination des nucléotides endommagés par la cassure et incompatibles avec la ligature des extrémités. En particulier Ku permet de produire des extrémités 5’-phosphate et 3’-OH compatibles avec la suture des brins par l’ADN ligase.
  • Recrutement d’autres protéines impliquées dans la réparation : Une protéine-kinase ADN dépendante (DNA-PK), une ADN ligase spécifique, une terminal-transférase.
    À chaque fois, la protéine Ku70/80 vérifie si l’hybridation est possible et si oui, c’est-à-dire s’il y a homologie de 2 à 4 bases, la jonction est stabilisée et la cassure a été transformée en deux lésions simple brin. Il y a alors comblement des éventuels régions simple brin restantes par une ADN polymérase qui prend comme matrice le brin d’ADN qui vient d’être réparé par la protéine Ku. Ku recrute également une ADN ligase spécifique (ADN ligase IV chez les eucaryotes, ADN ligase D chez les bactéries) qui suture les brins en reformant les liaisons phopshodiester clivées. Lorsque les extrémités de la cassure du brin ne sont pas nettes, la protéine Artemis va agir en supprimant quelques bases. Son activité endonucléase est aidée par la transférase terminale TdT et va rendre possible la suture des brins par l’ADN ligase. C’est lors de ce processus dit ’processus de fin’ que certaines bases peuvent être détruites et ainsi mener à des mutations. La continuité initiale du chromosome a ainsi été réparée mais sa séquence nucléotidique est changée par cette réparation biochimique : il y a donc introduction d’une mutation consécutive à la réparation. Le mécanisme de réparation par jonction d’extrémités non-homologues est impliqués dans la formation de la diversité du répertoire d’anticorps, au travers d’un mécanisme appelé recombinaison V(D)J. Les souris déficientes dans la jonction d’extrémités non-homologues ont ainsi un phénotype d’immunodéficience sévère… » - Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Jonction_d%27extr%C3%A9mit%C3%A9s_non_homologues ].

Tuladhar et ses collègues ont montré qu’au lieu de détruire totalement la fonction d’un gène ciblé par CRISPR dans 50% des lignées cellulaires étudiées, les indels induisaient une altération de la séquence en unités de base de l’ADN du gène, de sorte qu’il se produit de nouveaux types d’ARNm (molécules d’ARN messager) et de protéines.

Le Dr Michael Antoniou, généticien moléculaire basé à Londres, a déclaré : ’Ces effets non intentionnels sur le site modifié souhaité ont lieu après que l’outil de modification génétique a rempli sa fonction et résultent des mécanismes de réparation innés de la cellule. L’ingénieur en génétique ne peut ni contrôler ni prévoir le ciblage précis de la modification d’édition initiale, ce qui revient à dire que les problèmes peuvent être résolus en modifiant le système CRISPR pour qu’il soit plus précisément ciblé, en évitant ainsi une édition non ciblée : cela est faux’.

On peut nettoyer les mutations ?

Hahn et Nekrasov affirment que les mutations non ciblées de plantes modifiées par édition génomique peuvent être éliminées ’relativement facilement’ en retirant les plantes affectées du programme de sélection ou en les croisant avec des variétés élites de plantes non génétiquement modifiées.

Mais ce n’est le cas que pour les mutations visibles pour les ingénieurs en génie génétique - par exemple, celles qui provoquent des déformations ou une croissance médiocre. Les mutations qui provoquent des changements plus subtils, tels que la production de toxines ou d’allergènes, ne sont pas faciles à détecter et peuvent facilement passer inaperçues.

Comme l’a souligné Yves Bertheau, directeur de recherche à l’INRA, de nombreux changements induits intentionnellement ou non par les techniques de modification des gènes peuvent être transmis à la progéniture et figurer dans la variété de semence commercialisée finale. En outre, le nombre de rétrocroisements effectués avec des variétés élites pour les produits commercialisés est généralement inférieur aux six générations qui sont théoriquement nécessaires pour obtenir le niveau minimal souhaité de « purification » génomique de 95% [5].

Passage en revue des conclusions des auteurs - et des nôtres

Hahn et Nekrasov concluent :

* De nombreuses preuves suggèrent que CRISPR / Cas est un outil d’édition énomique précis lorsqu’il est appliqué sur des plantes.

Commentaires de GMWatch :

* Les auteurs présentent de nombreuses preuves selon lesquelles CRISPR n’est pas précis et que ces outils d’édition peuvent avoir des effets inattendus sur les sites non ciblés et sur les sites ciblés pour l’édition (’sites ciblés’).

Hahn et Nekrasov concluent :

* Dans la majorité des cas, il est possible d’éviter le ciblage erroné en concevant des sgARN spécifiques avec le nombre minimal de résultats non ciblés prévus.

Commentaires de GMWatch :

* Même si cela fonctionne comme prévu pour assurer le ciblage précis de la coupe d’édition souhaitée, sans perte d’efficacité - et cela n’est pas certain -, cela n’empêchera pas les effets inattendus de se produire du fait de la « modification » voulue.

Hahn et Nekrasov concluent :

* ’Bien que de nombreuses recherches supplémentaires soient nécessaires pour déterminer si des modifications involontaires sur la cible, telles que des insertions, des délétions ou des inversions chromosomiques importantes, induites par CRISPR / Cas sont un phénomène courant chez les plantes, il ne fait aucun doute que CRISPR / Cas est une technologie révolutionnaire qui permet de modifier le génome de plantes avec une précision sans précédent ’.

Commentaires de GMWatch :

* Les auteurs revendiquent une précision concernant la coupe ciblée initiale, mais affaiblissent cette affirmation en affirmant dans la même phrase que CRISPR et le processus de culture tissulaire associé, produisent également des effets inattendus sur le site ciblé, dont l’ampleur et les conséquences sont inconnues.

Hahn et Nekrasov concluent :

* ’Bien que CRISPR / Cas ait ses limites, en particulier en ce qui concerne l’efficacité de nombreuses installations expérimentales dans des plantes, il deviendra dans le futur certainement une technologie de choix pour l’amélioration des plantes et la sélection, à condition que la réglementation et la propriété intellectuelle et problèmes liés soient surmontés ’.

Commentaires de GMWatch :

* Le fait que CRISPR devienne une ’technologie de choix’ dépend de la capacité des ingénieurs en génie génétique de surmonter les ’limitations’ mentionnées dans cette même phrase, ainsi que de nombreux autres facteurs, y compris le type d’agriculture que nous souhaitons soutenir.

Comme c’est souvent le cas dans les articles scientifiques sur les OGM, les messages de propagande contenus dans l’examen de Hahn et Nekrasov sont nuancés et minés par les données réelles, y compris les données présentées dans l’analyse. Le vieil adage ’Le diable est dans les détails’ s’applique bien ici.

Références

1. Hahn F, Nekrasov V (2018) CRISPR/Cas precision : do we need to worry about off-targeting in plants ? Plant Cell Reports 38:437–441. https://link.springer.com/article/1...

2. Tang X et al (2018). A large-scale whole-genome sequencing analysis reveals highly specific genome editing by both Cas9 and Cpf1 (Cas12a) nucleases in rice. Genome Biology 19:84. https://genomebiology.biomedcentral...

3. Xing H-L, Dong L, Wang Z-P et al (2014). A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol 14:327. https://doi.org/10.1186/s12870-014-...

Andersson M, Turesson H, Nicolia A et al (2017). Efficient targeted multiallelic mutagenesis in tetraploid potato (Solanum tuberosum) by transient CRISPR-Cas9 expression in protoplasts. Plant Cell Reports 36:117–128. https://doi.org/10.1007

Andersson M, Turesson H, Olsson N et al (2018). Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery. Physiologia Plantarum. https://doi.org/10.1111/ppl.12731

Zhang Q, Xing H-L, Wang Z-P, et al (2018). Potential high-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR/Cas9 in Arabidopsis and its prevention. Plant Mol Biol 96:445–456. https://doi.org/10.1007/s11103-018-...

4. Tuladhar R et al (2019). CRISPR/Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation. bioXxiv, 20 March. https://www.biorxiv.org/content/10....

5. Bertheau, Yves. (2019). New Breeding Techniques : Detection and identification of the techniques and derived products. In : Melton L et al (eds.) (2019). Encyclopedia of Food Chemistry. Reference Module in Food Science. Elsevier. 320-336. 10.1016/B978-0-08-100596-5.21834-9. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780081005965218349?via%3Dihub

CRISPR/Cas precision : do we need to worry about off-targeting in plants ? (Précision de CRISPR / Cas : devons-nous nous inquiéter du non-ciblage dans les plantes ?) - Florian Hahn, Vladimir Nekrasov - Plant Cell Reports - April 2019, Volume 38, Issue 4, pp 437–441 – First Online : 13 November 2018
https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-018-2355-9

Résumé

La technologie CRISPR / Cas est récemment devenue un outil de choix pour la modification ciblée du génome chez les plantes et au-delà. Bien que CRSIPR / Cas offre un moyen rapide et facile d’introduire des modifications dans les loci génomiques d’intérêt, son application est associée à un ciblage non ciblé, c’est-à-dire à l’introduction de mutations non intentionnelles sur des sites non ciblés du génome, ce qui a souvent été rapporté chez le monde des mammifères. Nous résumons ici les connaissances actuelles sur la précision de CRISPR / Cas dans les systèmes de production et nous fournissons un résumé des stratégies les plus récentes pour éviter les mutations hors cible, ainsi que les modifications non intentionnelles sur la cible, chez les plantes. Celles-ci comprennent l’utilisation de nucléases CRISPR / Cas naturelles (par exemple, Cas12a) ou modifiées (par exemple, SpCas9-HF) caractérisées par une précision supérieure, par rapport à la SpCas9 de type sauvage, qui est communément utilisée. De plus, nous discutons de l’utilisation des nucléases CRISPR / Cas sous forme de ribonucléoprotéines (RNP) en tant qu’option pour réduire le ciblage des plantes. Enfin, nous concluons que le facteur le plus important pour la réduction du ciblage hors cible CRISPR / Cas reste la sélection rigoureuse des séquences cibles, pour laquelle nous fournissons une vue d’ensemble des outils logiciels en ligne disponibles et des conseils expérimentaux.

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Traduction avec ajout de compléments d’informations et intégration de liens hypertextes : Jacques HALLARD, Ingénieur CNAM, consultant indépendant – 26
/10/2019

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